Fusion gene detection 2014-Dec 及 TLCN檢體申請由 sufang 在 三, 01/21/2015 – 11:29 發表 Cholangiocarcinoma cholangiocarcinoma FGFR2 gene fusion Nov 27, 2014 at 2:57 PM To: Su-Fang Lin Dear SF, Only minor suggestions (in red color). Are you going to list the oncogenes screening in your proposal or we can just perform the exam? I am […]
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General Fluidigm Access Array + MySeq –YouTube 1: https://www.youtube.com/watch?v=s9HUhuCbbhU –YouTube 2: https://www.youtube.com/watch?v=WXpNjcRwdj8 –AA_Illumina_ug_100-3770 (pdf) –RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (pdf) 台大郭頌鑫醫師抽取DNA and RNA from tiny endoscopic biopsy samples使用。 –陳華鍵老師他們新開的公司行動基因,用的是類似方法、只是不同機器(Ion Torrent PGM/Proton) –Archer: Archer™ FusionPlex™ FGFR Panel (USD 495 / 8 rxn) –Life: Ion AmpliSeq™ RNA Fusion Lung Cancer Research Panel –與台大合作部分，詳見HPV and p16 in HNSCC. (按我連結) –ds-cDNA protocal from Yi-Mi and Dan (03/05/2015). (按我下載)
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關於CRISPR sgRNA的設計跟構築 除了委託廠商代工外 現在常用的方法 是利用外切 restriction enzyme去製造linear plasmid 再利用合成stick end 互補股引子的方式去 ligation 常用的restriction enzyme會是類似BbsI這類特別的酵素 因為他們的切點在辨識序列的外側 (5′ or 3′)來行成stick end 所以只要在合成primer的時後先預留正確的extra base 將回溶/reannealing/PNK 處理過的片段作ligation 就能得到sgRNA vector， 要在經定序後確認，即可得到sgRNA。 目前sgRNA的確認只能用定序的，因為塞入的片段太小(23bp)， 加上sgRNA設計的時候沒有在原始被移除的序列中加上vector其他部位已經有的切位 所以需要這部，或是可以在製造linear vector的時後check 不會有 uncut vector存在 addgene提供的 空sgRNA vector 多數是用這個方法(Humanized sgRNA是例外，我被暗算過)empty sgRNAhttp://www.addgene.org/crispr/empty-grna-vectors/ 裡面也有提供類似冷泉港的單一vector。 利用這個方式建構的sgRNA成本會遠低於委託廠商代工 主要花的錢包含vector購買(NT 3000)/ primer 合成 (~50 bp per clone)/ PNK 跟 restriction enzyme (各約莫三千元左右，可多次使用) 以下在附上我常用的sgRNA設計網站sgRNA
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