關於CRISPR sgRNA的設計跟構築
除了委託廠商代工外
現在常用的方法
是利用外切 restriction enzyme去製造linear plasmid
再利用合成stick end 互補股引子的方式去 ligation
常用的restriction enzyme會是類似BbsI這類特別的酵素
因為他們的切點在辨識序列的外側 (5′ or 3′)來行成stick end
所以只要在合成primer的時後先預留正確的extra base
將回溶/reannealing/PNK 處理過的片段作ligation
就能得到sgRNA vector，
要在經定序後確認，即可得到sgRNA。
目前sgRNA的確認只能用定序的，因為塞入的片段太小(23bp)，
加上sgRNA設計的時候沒有在原始被移除的序列中加上vector其他部位已經有的切位
所以需要這部，或是可以在製造linear vector的時後check 不會有 uncut vector存在
addgene提供的 空sgRNA vector 多數是用這個方法(Humanized sgRNA是例外，我被暗算過)
empty sgRNAhttp://www.addgene.org/crispr/empty-grna-vectors/
裡面也有提供類似冷泉港的單一vector。
利用這個方式建構的sgRNA成本會遠低於委託廠商代工
主要花的錢包含vector購買(NT 3000)/ primer 合成 (~50 bp per clone)/
PNK 跟 restriction enzyme (各約莫三千元左右，可多次使用)
以下在附上我常用的sgRNA設計網站
sgRNA design
http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
最後附上 sgRNA構築的protocol