On Sep-16-2008 AM 10:00, SFL wrote:
Dear All, 陳老師在上週三院務會議後,熱切地吩咐我要把Rta造成MN增加的現象(楚穎論文)再加幾個圖(仿常申之paper)希望Int. J. Cancer這一篇被接受後,能夠把Rta對GI的contribution由我們Taiwan人自己發表(餘略)
—————————————————————————–
三個成見(二不一會):
1. Rta’s function in the cytoplasm is NOT considered here.
2. Rta-mediated MN formation in cells during EBV lytic replication may NOT contribute to NPC tumorigenesis, because cells may die before MN are formed.
3. Rta does lead to MN and rH2AX formations in EBV-ve cells.
Rta, AKT/ERK and G2/M:
(1)歆蘭,勝彥,楚穎以及現在旻潔都提到Rta對M phase的加速離開有 貢獻.但是SFL詳讀楚穎論文圖七,八,九後覺得是否有可能表現Rta之細胞要進入M期受阻,所以在施以thymidine或nocodazole這類同 步化步驟時,M期細胞總數就較control組少(鐵證:圖九(B)中有Rta的細胞在0點時, CCNB/CDK1/AuroraB等M期蛋白均較solvent control組少),導致解除同步化後M phase加速離開的假象.
(2)同 理,會不會ERK1/2在某個時間應是被shut-down的(如圖七(B)solvent control r6, r8),但是有Rta時這個checkpoint的到達非常不容易,因此有Rta表現的細胞ERK1/2都是on著的,所以總量以western blot analysis分析時就較control組高.
要釐清這二點的話,應該:
(1)請再提醒我一下除了看M期各蛋白提前消失外,還用什麼方式證明Rta對M phase的加速離開有貢獻.
(2)現在旻潔double thymidine block的實驗中(陳老師說已非常完美),能否以flow驗證一下圖七(B)下面那個表格的實驗,看看release後每個週期的細胞群比例.
再來是讀完paper和聽到大家的實驗結果後的感覺與猜測:
(1) 當Dox一加,Rta被誘導出來後,p21/p27等等regulator跟著就被誘發出來/抑制下來(在transcriptional level).細胞受到這些”cue”所產生的表象就是緩緩地進行細胞週期:其中一些被迫停在G1,這些細胞S phase所須的材料都沒有準備好,因此無法繼續前進.能夠前進的則進入S phase,開始做DNA replication的工作,做完後進入G2,準備M期所需材料.之後依前類推凡是能突破checkpoint的就往下,不能的就等待.所以若能將細胞 同步化在某一點,release後以flow分析,有Rta的那一組,每個細胞週期的細胞數比例會與對照組不同,而這時候依照cell cycle變化,就可以說明Rta在HEp2中雖然無法讓細胞停住不再分裂,但是因為Rta及其衍生物擾亂了每一步驟的進行,而使生長曲線變慢.
(2) 可能是細胞的不同,293TetER是明顯地被停在G1 phase,但是HEp2TetER則是doubling time由24變51小時.這裡我的一個疑問就是:在這由1X變為2x的51小時當中,究竟是大部分有Rta的細胞都放慢腳步在複製,還是這個 population中有部份細胞Rta掉了,所增加的細胞數其實是來自這部份的貢獻.有沒有辦法區分這兩者?有用IFA做過Flag-ER在 HEp2TetER/Dox的陽性率嗎?另外一點隱憂就是,當我們在passage細胞時,其實許多cell surface molecules會傳遞訊號進入細胞內.所以對一些已被Rta及其轉活化產物作用到某一程度的cell,當你以”盤子滿了,得passage!”的步驟 處理後,細胞肯定又加入許多signals,說不定reset所有之前Rta及其轉活化產物所累積的”功德”.這一點要想一下怎樣control或是證明 沒有effect.
(3)Akt/ERK1/2的持續活化應該是來自於Rta/Rta轉活化產物的共同效應(you can not agree with me more, right?).這些點找出來paper就有了,Rta促進MN產生就有機制了,晚上睡覺時就不會覺得好像哪裡不對勁..相反的不管這些點硬要說Rta在 細胞質裡somehow activates ERK1/2, AKT,p38,JNK…或是Rta表現somehow促進MN產生而造成NPC GI,這些都有點偷岬步令我無法信服(I can not agree with them anymore).
(4)According to陳老師,這些data最好是速速整理成論文發出去,被PRC搶先發表他會很難過的.通訊作者是許老師,第一作者未定.我個人頃向由勝彥,楚穎,旻潔協調出一人來.主要菜色建議這樣端出來:
Title:EBV Rta induces MN formation in HEp2 cells.
(Figure 1):Rta increases the doubling time of HEp2TetER from 24 h to 51 h by delaying the progression of cell cycle in G1,xx and yy, while promoting the exit of M phase (真的嗎?).
(Figure 2):Constitutive activation of AKT, ERK1/2, and xx signaling proteins are observed in Rta-expressing HEp2 cells.
(Figure 3):MN formation is dramatically enhanced in HEp2 expressing Rta (全上囉,圖啊,表啊of bi-nucleated, multi-nucleated, mis-segregated,以及日後的karyotyping)
(Figure 4):Rta-associated MN is mediated by ERK1/2 signaling pathway (U0126)
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of M phase pre-exit(論文圖八圖九), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of p21’s interference in G2/M(楚穎的救命寶), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of constitute activation of ERK1/2(by DUSP3 or BRAP2最好不要是這個), or,
Figure 5 and more:newer results and corrections from 各位!
加油了,米那桑,把走過的留下一點痕跡吧!
試試看囉,看看會不會跟!