On Sep-16-2008 AM 10:00, SFL wrote:
Dear All, 陳老師在上週三院務會議後,熱切地吩咐我要把Rta造成MN增加的現象(楚穎論文)再加幾個圖(仿常申之paper)希望Int. J. Cancer這一篇被接受後,能夠把Rta對GI的contribution由我們Taiwan人自己發表(餘略)
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三個成見(二不一會):
1. Rta’s function in the cytoplasm is NOT considered here.
2. Rta-mediated MN formation in cells during EBV lytic replication may NOT contribute to NPC tumorigenesis, because cells may die before MN are formed.
3. Rta does lead to MN and rH2AX formations in EBV-ve cells.
Rta, AKT/ERK and G2/M:
(1)歆蘭,勝彥,楚穎以及現在旻潔都提到Rta對M phase的加速離開有貢獻.但是SFL詳讀楚穎論文圖七,八,九後覺得是否有可能表現Rta之細胞要進入M期受阻,所以在施以thymidine或nocodazole這類同步化步驟時,M期細胞總數就較control組少(鐵證:圖九(B)中有Rta的細胞在0點時, CCNB/CDK1/AuroraB等M期蛋白均較solvent control組少),導致解除同步化後M phase加速離開的假象.
(2)同理,會不會ERK1/2在某個時間應是被shut-down的(如圖七(B)solvent control r6, r8),但是有Rta時這個checkpoint的到達非常不容易,因此有Rta表現的細胞ERK1/2都是on著的,所以總量以western blot analysis分析時就較control組高.
要釐清這二點的話,應該:
(1)請再提醒我一下除了看M期各蛋白提前消失外,還用什麼方式證明Rta對M phase的加速離開有貢獻.
(2)現在旻潔double thymidine block的實驗中(陳老師說已非常完美),能否以flow驗證一下圖七(B)下面那個表格的實驗,看看release後每個週期的細胞群比例.
再來是讀完paper和聽到大家的實驗結果後的感覺與猜測:
(1) 當Dox一加,Rta被誘導出來後,p21/p27等等regulator跟著就被誘發出來/抑制下來(在transcriptional level).細胞受到這些”cue”所產生的表象就是緩緩地進行細胞週期:其中一些被迫停在G1,這些細胞S phase所須的材料都沒有準備好,因此無法繼續前進.能夠前進的則進入S phase,開始做DNA replication的工作,做完後進入G2,準備M期所需材料.之後依前類推凡是能突破checkpoint的就往下,不能的就等待.所以若能將細胞同步化在某一點,release後以flow分析,有Rta的那一組,每個細胞週期的細胞數比例會與對照組不同,而這時候依照cell cycle變化,就可以說明Rta在HEp2中雖然無法讓細胞停住不再分裂,但是因為Rta及其衍生物擾亂了每一步驟的進行,而使生長曲線變慢.
(2)可能是細胞的不同,293TetER是明顯地被停在G1 phase,但是HEp2TetER則是doubling time由24變51小時.這裡我的一個疑問就是:在這由1X變為2x的51小時當中,究竟是大部分有Rta的細胞都放慢腳步在複製,還是這個 population中有部份細胞Rta掉了,所增加的細胞數其實是來自這部份的貢獻.有沒有辦法區分這兩者?有用IFA做過Flag-ER在 HEp2TetER/Dox的陽性率嗎?另外一點隱憂就是,當我們在passage細胞時,其實許多cell surface molecules會傳遞訊號進入細胞內.所以對一些已被Rta及其轉活化產物作用到某一程度的cell,當你以”盤子滿了,得passage!”的步驟 處理後,細胞肯定又加入許多signals,說不定reset所有之前Rta及其轉活化產物所累積的”功德”.這一點要想一下怎樣control或是證明 沒有effect.
(3)Akt/ERK1/2的持續活化應該是來自於Rta/Rta轉活化產物的共同效應(you can not agree with me more, right?).這些點找出來paper就有了,Rta促進MN產生就有機制了,晚上睡覺時就不會覺得好像哪裡不對勁..相反的不管這些點硬要說Rta在細胞質裡somehow activates ERK1/2, AKT,p38,JNK…或是Rta表現somehow促進MN產生而造成NPC GI,這些都有點偷岬步令我無法信服(I can not agree with them anymore).
(4)According to陳老師,這些data最好是速速整理成論文發出去,被PRC搶先發表他會很難過的.通訊作者是許老師,第一作者未定.我個人頃向由勝彥,楚穎,旻潔協調出一人來.主要菜色建議這樣端出來:
Title:EBV Rta induces MN formation in HEp2 cells.
(Figure 1):Rta increases the doubling time of HEp2TetER from 24 h to 51 h by delaying the progression of cell cycle in G1,xx and yy, while promoting the exit of M phase (真的嗎?).
(Figure 2):Constitutive activation of AKT, ERK1/2, and xx signaling proteins are observed in Rta-expressing HEp2 cells.
(Figure 3):MN formation is dramatically enhanced in HEp2 expressing Rta (全上囉,圖啊,表啊of bi-nucleated, multi-nucleated, mis-segregated,以及日後的karyotyping)
(Figure 4):Rta-associated MN is mediated by ERK1/2 signaling pathway (U0126)
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of M phase pre-exit(論文圖八圖九), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of p21’s interference in G2/M(楚穎的救命寶), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of constitute activation of ERK1/2(by DUSP3 or BRAP2最好不要是這個), or,
Figure 5 and more:newer results and corrections from 各位!
加油了,米那桑,把走過的留下一點痕跡吧!
被點名了, 大驚 !!!
我也嚇了一跳說……
當年趕著畢業的時候，我只有很草率的拍了一些照片，還來不及數不正常的細胞增加了多少，就閃人了，所以現在的狀況是有善良的志工要幫我數嗎？感激不盡！
嗯……我想旻潔應該不會很介意大家叫她敏捷的！
自己照吧,自己的slide自己算才有感覺.若算出有difference(p<0.05),那很多人得到解脫(反之亦然啦)先看bi-nucleated,multi-nucleated, 另一種就是許老師口中mitosis不完全那一型(兩顆中間有拉絲的).好好幫忙統計一下,搞不好你那三不五時偷偷在想的美夢會成真!另外能否請小旻潔問一下阿波師家仕軒先輩,有關送檢體至NTU田醫師Lab做染色體變化是否真的可行.謝謝.(不清楚處盡量問,想好了再動手)
還有,還有,陳老師把一份論文交給旻潔做參考.據說有一篇paper已發表在JGV (Rta及ERK upstream).能否幫忙打探一下到底是那一篇.找都找不到滴勒.
那篇論文我也找不到說……快成為傳說了！
自己算bi-nucleated cells？！那我很可能會得到魷魚炒一盤。我記得之前大致算過，表現Rta144小時後，不正常的細胞核比例大約是180/500，其中多核的細胞大約佔了1/10左右，有牽絲的細胞核是最大宗的不正常狀況，佔了不正常的細胞的50%，另外還有空洞化的細胞核、扭曲的細胞核、特別小的細胞核與異常巨大的細胞核。
根據這些觀察，我覺得正式統計應該會有意義的，該怎麼解釋這個現象，和Rta是否有直接相關，這就要再仔細想想清楚了。
旻潔說，paper還沒published，還要再等一下下才會看到網路版，現在她手上的是那個博士生的論文初稿是也。
我有點想把p21的量/mitosis checkpoint這二者間的因果關係弄清楚.很難理解細胞生長速度變二倍慢這件事.可能是一部份停住不長造成的嗎?因為算的總數啊.
這是個太過複雜的狀況……
一部分不長的意思是？
我的想法是這樣的，p21在高表現量的狀態下，其實只是暫停下細胞週期運行的進度，並不會讓細胞不長，長時間都不分裂的話，這細胞應該會走向久病厭世的路線吧。
現在並沒有任何直接實驗data指出p21和mitotic checkpoint執行有關，只有觀察到M phase時p21如果並未被APC/C-Cdc20解決掉的話，會出現Cdc2/CyclinB活性受到抑制，造成M phase delay的現象。(請參考Amador et al., 2007, Molecular Cell 27:462-73)
p21是個令人困擾的問題，別人的實驗結果乍看之下又和我們已知的不大相同，現在的狀況真是……麻煩得不得了…….^^a
好比說ER/p21高的細胞在48小時內就停止分裂了;細胞核產生奇怪變化的這些細胞也會陸陸續續停止分裂;而還能分裂的就繼續一分二,直到細胞內的ER/p21高到可以arrest growth.但是你在算細胞總數時,所呈現的就是群體的doubling time愈來愈長(只靠那些能分的在貢獻數目).要證明這一點還是得做一個synchronized/Dox treated cells的flow.如果大部份細胞增生速度都變慢的話,那是每一個phase都受影響,還是只有G1?(然後M變短?)
正解是……Rta對每個phase都有影響！
現在的狀況有點詭異，synchronization之後發現，Rta似乎對每一個phase都有影響，G2和M的部分已經想到怎麼解釋了，但是S期就要再想一想了……
頭有點痛……如果有高人想出來的話，請為我指點迷津，感恩！
Rta的辛苦產物可以嗎?p21不是會去干擾PCNA所以S phase肯定受到影響.p21很可愛耶,小龜都不喜歡它…
我沒有不喜歡p21啊！
只是p21牽連太廣，有的時候會讓我想不出因果關係，很傷腦筋而已，所以乾脆先放一邊好了。
想到p21就會想到它會抑制CDK-cyclin complex的活性，所以會延長cell cycle的時間，p21的表現量是由細胞內部的ubiquitin ligase調控，而隨cell cycle改變，也就是說，p21的表現量是有高低變化的，但在Rta的例子中，p21表現量的狀態就不太一樣了，在一直高表現量的狀況下，cell cycle仍能緩慢的推動。我記得之前有看過關於p21的文獻中有提到，有些cancer cell天生就是p21高表現量的狀態，但這些cell還是長得好好的，所以我想，p21抑制cell cycle進行這部分應該不會造成細胞真的不分裂，但一定會影響cell cycle運作，至於是什麼樣的mechanism讓cell cyle繼續運作，這就是個難解的謎了。
另外，持續表現p21是否真的會造成genome instability，這就真的要再找找文獻了，我看到大多數的文獻都傾向認為p21是維持genome integrity的關鍵……
順帶一提，已知p21持續高表現量一段時間，在p21量開始減少，會出現endoreduplication的現象，所以當年無腦小龜還在做實驗的時候，有試過在keep induction狀態下收細胞(keep induciton到後來，p21會變少喔！)，以flow計數4N的細胞是否有變多，做了幾次實驗，都有一個問題，就是control組都沒有固定好，所以無法確認keep induction之下，是否也會有p21-induced endoreduplication的現象；在IFA的實驗中，能觀察到多核的細胞數量增加，這個結果和flow的結果不太match，這需要再進一步confirm。
有很多狀況是我這個無腦型小助理無法理解的，這個艱難的任務就交給素芳老師和旻潔妹妹了！我想，能好好的想清楚應該怎麼解釋學長姊們觀察到的現象，應該是比較有趣的事(謎之聲：與火速發paper比較……對不起我是卒啦)。
傳聞中的Paper終於出來了,但是..只有最後一個圖和ERK signaling有關.那個co-localization的圖三也有點怪.總之有興趣的人看一看,我們再來討論!我有一些新想法,今晚睡飽後整理一下明天再公佈.謝謝小龜,小龜的學長,學妹!
果然睡眠債還沒還完……我現在頭昏腦脹到非常想找隻兔子痛毆一頓……下次實驗室有多餘的耗材經費的時候,可以買一些兔子娃娃備用嗎?或打地鼠機也是很好的選擇,以嘉惠未來的學弟妹們.阿彌陀佛,善栽善栽.
關於老師提到的,鐵證:圖九(B)……略,這個部分,答辯人想提出異議,答辯內容如下:那個實驗是以mitotic shake-off收下於M期之細胞,再取其細胞溶解液,進行western blotting,所以應該看不出來,所謂的M期細胞數的差異.由定量得知,也沒有所謂的CCNB等表現量減少的狀況,但這個實驗非常非常非常難做,一有個閃失(細胞狀態不好,密度不對等族繁不及備載),就做不出這樣的結果,這讓我非常頭痛兼慚愧.
要觀察M期是否提前離開,我是以nocodazole將細胞synchronize在M期,解除同步化之後,以flow的結果統計細胞離開M期的比例對照時間,發現Rta會讓細胞比較快離開M期.
我計算生長曲線時,是維持五天沒有passage的狀態,可以看到細胞仍會緩緩地~緩緩地長大,所以能不能解決上述猜測(2)呢?inducible clone有90%會表現rta,這會有個問題,剩下的10%在五天後是很有可能會取代原本會表現Rta的細胞,成為山大王,但這個問題我是這樣想的,我有看過歆嵐學姊之前做過的一個實驗,在nocodazole移除後40個小時之間持續追蹤有無rta表現的細胞細胞週期移動的情形,發現有Rta表現的細胞並未如預期的停在G1(因為p21/p27之類的原因),有持續往前推進的現象,這個結果讓我相信,rta讓細胞週期停下的效果,應該只是暫時性的,又或者,我猜之前的實驗多半以transient transfection做的,rta表現量過高或許會引起一些其他的現象,且不容易做這麼長一段時間的追蹤實驗;另外就是比較糟糕的部份了,在HEp2這個system中有些什麼我們現在沒想到的特殊狀況,導致Rta在這裡能做到在其他地方做不到的事.
最後那個”楚穎的救命寶”我想更正為”Shapiro大神的神蹟-2″.能找到AIM-1也多虧Shapiro大神咧!也只有他們加才做得出這麼完美的double thymidine block,可以區別出每個phase的時間,羨慕……
基於敬老尊賢的角度,我想請把貢獻最大的勝彥學長放在最前面吧!
基本上我沒有做什麼耶!靠著學長學姊的餘蔭和旻潔妹妹的努力不懈罩著混吃騙喝,撈到學位已經很感謝了.
抱歉,因為封網限制讀者的關係所以今天才讀到你的回文.那個圖九在0點時CCNB,CDK1,Aurora B都是定起量來差不多的嗎?是用什麼方式定量的?x-ray film加xx軟體嗎?我記的從第一次你show這張圖我就一直問這個問題(mental block啊)
有關”歆嵐學姊的Rta在40h內仍然無法將細胞停住..”是不是有這種可能呢?針對每一種細胞而言,p21或p27要到某一個量,G1-arrest的check-point才會被活化,量還不足時細胞仍能進入S,連帶的p21/27就被帶到S或G2/M,然後看要arrest intra-S或G2/M的量夠不夠,依此類推.當然這同時也要顧慮到p21這些分子被送出核和被分解的情形.如同293TetER是要到第三天才有細胞總數減緩現象.所以啊,寫論文的重點就是把我們的觀察描述給別人聽,在描述時因為要找切入點所以要讀(許多很多更多)別人的文獻,理不出頭緒時真的很悶啊.(ps.你可能崇拜錯人啦,做double thymidine block的神應該是第一作者,Shapiro是造神者..)
關於,p21/p27的量量要到一定程度才會有arrest的現象,就我的認知的確是這樣的,細胞會累積p21,而後再由ubiquitin ligase和protease將它分解.
但我現在不明白的是,老師的問題是?
我的印象是Rta會造成p21增加,不會因cell cycle而改變,意思就是和control比較,表現Rta的細胞p21就是必較多.
就是說雖然在表現Rta的HEp2中p21確實是比control高,但是HEp2對p21的耐受力也大(threshold高).所以即便還有一些量的CKI存在,G1/S的checkpoint還是可以允許S phase progression.同理G2 checkpoint也是讓細胞進入Ｍ期隨便它愛怎麼分就怎麼分.會有這種可能嗎?這樣的話,走過一,二,或更多個cycle後如果在生成與分解不斷較量之下,CKI濃度終究達到”必須停住”的量,那cell就growth arrest.反之,分解速度終於超過生成,那細胞growth curve會越來越快.因為我們得理出我們到底要說絕大部份Dox-treated的細胞,它們的特性是什麼.如果doubling time是51小時的話,那麼在第102小時有看到4倍的細胞數,還是doubling time會繼續拉長?還是arrest在”行成MN那一步”大致上我就是想釐清這一點!謝謝！
我還是不懂老師的問題,果然變笨了,畢業三個月就變阿呆了……接下去就會變白癡吧!
我想想喔,老師是不是想問,細胞在p21動態變化中,是不是總有到達可以arrest的量的一天?在arrest之前,是不是能看到cell cycle越來越長的現象?如果停下來,是不是停在MN生成的那一個時間?
對極了,還沒變笨嘛.不過我並非一定等到arrest的那一天.而是想問清楚,一直以Dox處理的細胞,也就是Rta一直表現的HEp2,要怎麼來形容?是保持51小時增殖一倍呢?還是表現Rta的細胞群終究會不見?若是後者,那表示Rta及其活化分子最後還是戰勝cell cycle,細胞終究要不就arrest,或產生MN,或apoptosis/necrosis(所以這種細胞漸漸被淘汰掉).而這種現象只有用inducible cells才觀察得到,transient-transfection或constitutively expressed stable lines是無法得知的.Agree?
我沒辦法回答這個問題……
很久很久以前的某一天,小龜很不知死活的做了一件很蠢的事,就是keep induction超過一個月,一心一意等著這些inducible clone久病厭世的那一天來臨……
但是當我等了一個半月後,細胞仍然長得好好的,我沒辦法解釋在這期間觀察到的一些怪事……
1.在induction的前幾天,細胞是越長越慢的,也就是說,其實doubling time越來越長,但到了某一天之後,生長速度會慢慢的恢復接近control(請注意,計算growth curve時,得到的doubling time是”平均值”,無法得到每一個點的實際值)
我要附註:細胞並沒有大量死亡的現象,如果老師說:會不會細胞一點一點的死掉了?所以到後來才會看到生長速度慢慢恢復?這個問題我沒辦法回答……
2.我再想,其實我們用的HEp-2細胞的background是不是有點怪異,它的p53對DNA damage signal是不太反應的,但似乎又不是p53的全部功能都消息,RB是好的,但據我所知,這樣的細胞在p21高量之下,會有senescence的反應,但HEp-2長得還不錯……
3.在induction到後期時,HEp-2的形態會改變,似乎有漸漸失去它原本的特性的感覺,變得不容易trypsinize,不容易疊起來,細胞核和細胞質的比例怪怪的,原本長得很好的時候細胞膜外會有一層東西,後來都消失了
小龜現在只想得到這麼多了,年紀大了就變笨了……
ㄟ……附註一下,p21要12小時左又才會增加喔!
(1)好像是喔,是十二小時才明顯增加.所以加入Dox後,一小時Rta就表現,5~6小時達到peak.而p21是到Dox加入後十二小時才明顯增加.
(2)基本上in vitro culture的癌細胞不會久病厭世,除非你放任他medium變黃,不再供給任何養份.要不即使在DMEM basal medium中培養,它只是進入所謂的G0,不會死的.
(3)如果我們只針對有Rta表現時間內,對細胞產生功能的部份做敘述的話,是不是可以寫成這樣:這一段時間內〈暫訂為144小時〉p21在第12小時大量增加,但會隨著Rta減少而漸減。前四天細胞複製變慢一倍,第六天左右接近15%的細胞有MN產生,M phase exit時間會變短,這部份推測與MN產生有關。Rta為什麼會變少,是大部份細胞變少還是一部份沒有Rta的細胞out-grow造成,目前並不清楚。
(4)旻潔10/30(Thu) 9:00 progress report,可以跟老師請個假下來幫忙聽一下嗎?
好像也只能這樣寫了……有種不停再繞圈子的感覺,是不是要再多看看別的paper,開發一些新的路徑突圍呢?
還有很多問題是一直想不出來或無解的,頭很痛.
很想試試看p21到底會不會跑到細胞質裡……但是這一切都只是個白日夢,多想無益.