心得彙整暫存區

1.一週三天有固定時間不能做實驗,會不會太沒效率了?來和與星期二下午的大瞇合辦怎麼樣? 就是說當天不在大瞇報的二個人就在小瞇報. 小瞇就排在大瞇前一小時,也就是一點或一點半和SFL討論.這樣一來平均每種meeting(被瞇得昏昏欲睡了吧)就是二個星期報一次. SFL昨天確實有被擊垮的感覺 （還是太久沒好好靜坐了?）2. RAZ 最早是小Kenney和飄魄的Pagano發現的.這個實驗室和英俊的Sergeant有進一步探討 3. Transcriptional activation 與 轉錄因子phosphorylation 正相關之例子搜尋4. 低溫長時或高溫短時對GST-N600/GST-Q658之水溶性影響, KR OGlcNAc 最後一張圖待補5. CKI與老化 (ERKV與PI3Ki/CKI) 6. Failure in 293/green EBV (DNA from ingrid or CGU)

CCL:亞硝胺stock分裝成小包裝,每次拿一瓶aliquot出來用,用完即扔不重複使用. 請再做一次Dox (5 ng/ml) alone,24~72小時的提引(若細胞夠再加入亞硝胺部份(0.05 ug/ml)的實驗組). 預期的EAD expression kinetics 請參照白板上心瑋/小嬿之powerpoint列印檔.謝謝.

Team-work部份結果已出爐, 正商請李老師幫忙分析中。綜合目前western結果,小丸子的二批檢體都有 wash-off現象,小蓮的檢體正以EV、KV downstream protein來確定標示問題。等確立完成後再來萃取RNA。Ingrid的兩批則較沒有wash-off現象,原因不明。另一批要抽RNA的檢體是沒有 dox的control。小結:Team-work–>Perfect!看來我們會得到一張相當不錯的地圖的。很振奮耶,米那桑。

Team-work部份western的圖已上傳至nas.請自行下載並幫忙檢查有沒有標錯,謝謝.

SFL:(1)注意HEK293的lineage並非epithelial(資料一,資料二);(2)發現很棒而且免費的大衛軟體for gene list analysis(這裡).

SFL:報告cell cycle/p53 signaling/ECM之mapping結果。

SFL:報告DAVID mapping microarray結果。

(報馬仔:台北木棉花開了,二高90這一段油桐花也開了,春天來啦!!)

(ps決心很重要–Ichiro就是把放手一搏的決心養足後才敲出來那支完美的二分安打的!崇拜啊…)

這是Khoo的新網誌.Blogspot真是好用,大家都喜歡!

1) 小嬿: 忘了收的sample, Rta竟都掉到90kDa左右. Interesting…

2) Dr. Misha Blagosklonney終於踏入學術界..(這裡,要往下拉一下才看得到news; 以及Jun 15刊載3~4篇他當初想與我們合作的文章,扼腕!小夏,可否請你讀一讀,然後在lab meeting與我們分享一下他們系統與我們系統的異同,謝謝!)

comments: (1) 對了小夏,昨天開會宣佈,欲申請出國開會補助的人請於二週內繳一份abstract給秘書Amanda.(2) 好快! 一次出四篇!!! (驚) (natsumi) (3) 還有就是呼喚小龜:小龜,小龜,好久不見了.不需要上來透透氣嗎?夏天來囉 (4) Hey,你出現了!常常不時還是會想到你與還未謀面的小PWW.我們也很努力在生喔(pxpxrs啦),大家一起為台灣加油. (5) 好cool的網誌…(PWW)

SFL: reactivation paper進度報告.

都安全歸來囉! 我們每人會做個簡短的報告,趕工中,敬請期待.

KSHV Meeting Reports – 完畢. 謝謝各位! 希望對KSHV/EBV這兩個人類腫瘤病毒的致癌機轉有更深的認識!!

沒有人報告耶.. 不過Izumiya桑的包裹號碼為:809412091156 使用祕方如下:

Concenstration of purified K-Rta is 0.1 ug/uL.

Concentration of anti-K-Rta antibody is labelled on tube (2 ug/uL).

You can use it 1:4000 dilution for W.B. It can be used in IFA (1:500-1000), IP (3 ug/IP) as well as W.B. It is extremely sensitive.

From S.-P.: 有病毒的細胞若長期讓它老了/滿了,則spontaneous lytic 機率大大增高.例如EV同樣由p10至p20,若保持5%的血清在培養,則induction rate (anti-Z flow analysis)可由9%至89%;但是若用10%的血清在培養,則induction rate變成39%至89%。謝謝S.-P.做這個實驗,我想我得到的啓示是:

1)今後無論做哪種細胞,盡量把early passage大量繁殖,貯備凍管。

2)平常passage採一週二次制,如一、四; 二、五或三、六 (2~3百萬個細胞/p100-mm)。

3)解根凍管後,實驗盡量在一個月內做完(約十代內)。

4)除隔天須八、九成滿的實驗如L2K TF、primary infection外,盡量馴服cell活在7.5% serum中。

漂流~喵 and cate: cytotoxicity of “You-Know-What” (中譯:那個藥): TW01: 72/35 nM; Hone-1: 89/42 nM. 對EV lytic replication似有initiation作用 (興奮中…)

yang: Screening of six TW01TetER cells from ingrid (#7 似乎okay, 結論待續) .

適逢院內”研究日”第二天, meeting暫停一次。大家把握機會與院內其他高手好好交流。

SFL的感想: 常常說western blot analysis不是我喜歡的技術之一,因為它耗時耗錢,而且不quantitative。可是我期許它是你們喜歡的實驗,而且是強項。所謂強項就是如火 純青,出神入化,充滿熱情。就是看著別人很髒的結果猜得出來哪裡搞砸了,很弱的band知道下一次該怎麼樣讓它測得出來,包括找到更好的抗體或是發現更好 的偵測辦法。拜託各位囉,多參考別人家是怎麼做出可發表的結果。千萬不要讓學長/老師鼓勵的話迷昏頭,我們離perfect還很遠,基本功並沒有完全紮實 練好。

Maruko:要不要考慮這個跟這個,還有一個這個.

另外S186A是一個至今仍然未解的有趣mutant. 它可以bind DNA,可以transactivate一些promoter,有被訂出in vivo是被PKC磷酸化,但似乎此位點磷酸化的有無與disrupt latency無關.所以此例子並不適合追太久..

Maruko: (1) 為確保293TetKR中仍是每個細胞均具有transgene,小丸子成功地以flow demonstrated that, although weak, but Dox treated 293TetKR homogeneously shifted the anti-flag staining (1:50) to the right (not seen in 1:100 staining). 這樣子的結果可以讓我們安心的繼續使用這個細胞株.當初其實很怕是部份細還有KR,部份細胞則沒了,而以immunoblotting 又分不出來,所以小丸子勇猛地做這個實驗(熱烈鼓掌 霹靂啪啦 霹靂啪啦)智者常言:打鐵趁熱,所以讓我們也篩一下ER.能否請小蓮協助/學習小丸子把手中的293TetLuc及TetER也做一次這樣的實驗,我猜KR不幸是最弱的表現者. (2) GAL4 antibody 確定再訂一支同廠牌新貨. (3)下週決定CDK IP-kinase assay 事宜.

附註: (1) 類似的兩片immunoblot如果出來的intensity不同(如一樣是20 ug protein,染b-actin時一片強一片弱),大家要考慮(用你的左腦)是不是transfer efficiency不同?還是blocking/hybridization不同(buffer盡量蓋滿)?還是ECL呈色時心有所偏 (solution盡量蓋滿)?還是還有其它原因?為Lab/地球省資源是一件美事,但是將錯就錯凡事推給我也不知道,然後再發表了沒有人可以 repeat的結果,那就是我們的不對了.所以請大家運用智慧該省則省,該用則用,切莫因小失大. (2) 293 transfection不佳一事,持續追縱/探討中.有任何想法請隨時提出討論. 謝謝!

PS: 昨 晚狂掃所有KR做activation的paper 及十多篇Sp1在JBC上做luciferase assay的paper,發現activator:reporter的量竟然是在3:1 ~1:5之間. 只有韓國一個lab和我們一樣是做1:10. 真是太令我訝異了!讓我們好好測一次ratio吧!

Maruko:Flag- IP有初步結果,繼續微調其它調件;latency disruption籌劃中;全長的pLenti系列DLR操作完畢,等待機器修復中;slide上那個”pAN-Luc”要改為PANp-Luc或 PAN-Luc(這是學他們做ChIP-chip的人們說的)PAN stands for polyadenylated nuclear 是本人10年前花了好幾個晚上想出的名子,請務必保留…(另外一個UCSF group想出的叫nut=nuclear transcript=T1.1,我覺得我的小孩名子叫起來比較好聽耶.嘿嘿嘿,老灰阿說起歷史就停不下來,sorry)

Maruko: 利用293/KSHV做transient transfection,收72h的細胞做Flow紅光測試(還要扣掉背景值、綠光瀰散過來的值,小丸子你實在太強了)。366/367EE呈現稍降情 形,634/636AA則有明顯defect。準備重復此實驗,並加收96h的sample。DLR部份實驗幾近完成。全力搶攻CDKs(still looking for papers of VP16, tat and P-TEFbs, Sorry. Will let you know once I found them)。

Maruko: 利用293/KSHV做transient transfection,收72h的細胞做flow紅光測試。366/367EE呈現稍降情形,634/636AA及NLSm則有明顯defect。另 一半細胞(1/2 well of 6-well plate)做KbZIP western analysis, 除NLSm外餘符合flow data。

Maruko: 利用293/KSHV, 293FT/KSHV, KRKV-, KRKV+做disruption latency的實驗,收72h的細胞做flow紅光測試。634/636AA有明顯defect。雖然重新解凍的293/KSHV background紅光有明顯降低,但還是以293TREx細胞效果最好。Flow 技術真是已達爐火純青的地步,於此再讚美一下!293FT/KSHV那一組KbZIP western 結果符合flow data (請記住NLSm無論何時一定放在整組實驗的最旁邊。為什麼呢?因為NLSm偷偷進核的現象與原因有待天才型科學家來解決,在那一天來臨之前大部份有關它 的實驗數據都不將被列為”可發表”、是會被隱藏的)。

Maruko: (1)整理出PANp/full-length與pFR-Luc/GAL4_TA系列的DLR結果(真的是辛苦你了)。很conclusive的結論有 (a)S634/S636的絲胺酸比S644/652重要,(b)634/636dm誘導溶裂期功能比wild-type顯著降低。為了對mass- spectrometry訂出的細胞質內磷酸化位點513及514有個交待,請把那一部份的結果也整理一下,謝謝。 (2)513及514誘導溶裂期功能發現是較wild-type略低(both in 293 and 293TRex),是因為新prep的plasmid的關係嗎?檢查中。(3)CDK5及CDK9 IP部份還是沒有顯著結果。推測可能與(a)wash buffer (b) quantity of starting material (c)wrong guess to begin with. SFL正用力推敲中…

2008/12/16 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:檢測KR與mutant穿染至293/rKSHV或293Tet/rKSHV中,各個下游基因的表現情形。KbZIP結果最符合Flow/PANp的結果,ORF59與K8.1效果不佳。著手以IFA測試ORF59之表現。

2008/12/23 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:Set up IFAs for ORF59 and K8.1.

Maruko:以ORF59IFA作為另一個比較KR及634/636AA誘導細胞再活化之能力的測試。

小丸子:開使測試DRB與Roscovitine.

Maruko:繼續CDK9抑制劑對KR轉活化PANp及蛋白質穩定度之影響。

共用培養液遭污染,開始分家?要不要一起來清一下冰箱?因為它實在太小了…

小丸子:Ectopic expression of KR is stablized by Roscovitine and DRB while transactivation of PANp is inhibited by both inhibitors.

小丸子:(1)513/514點的DLR圖確定。(2)DRB/Roscovitine對KR-mediated PANp之影響(我給你稱讚有做634AA的control)。

Maruko:DRB/Roscovitine對KR及634/636之影響確定。

Maruko:整理513,514 RLU結果,報告CDK9對S634/636之影響。考慮以更多kinase inhibitors來找出phosphorylate S634/636之kinase(s)。

小丸子:一系列的藥物篩選,為了找出S634/636的主要激脢!加油,有點影子囉!

小丸子:Systemic inspecting the effects of various kinase inhibitors on KR molecular weight and protein stability regulation.

小丸子:整理U0126及JNK pathway對KR molecular weight shift所造成的可能影響。

小丸子:Flow cytometry analysis of dox-treated EREV8. 病毒歡喜再活化的環境應該是…

Maruko: Titrating KR polyclonal antibodies; 整理三條MAPK signaling pathway inhibitors對KR之影響.

2009/01/29 SFL wrote：論文大綱:

A) 先前合作實驗室發現EBV Rta在細胞質內具有活性,因此想要測試K-RTA是否在細胞質內亦具有功能。所以根據電腦NLS預測程式構築三株可能會導致K-RTA留在細胞質內的 NLS 突變株,分別是NLSm, NLSm1, 及NLSm2。結果顯示只要將位於527-530的KKRK變為AAAA,K-RTA就會大部份被trap在細胞質內(IFA結果),以western看 時KKRK這個位點的突變似乎會造成蛋白質表現量較多,而且會有明顯的一條小wt大約14kDa的band出現。猜測是核內PTM之故。

B) 欲進一步研究NLSm之功能,構築293TetKR及293TetNLSm Dox-inducible cell line。由這兩株細胞株的KR及NLSm做subcellular fractionation證實114kDa的band一律在nucleus的fraction,而98/100kDa的band則落在細胞質的 fraction。為了進一步瞭解這98/100kDa在細胞質內被磷酸化情形,affinity-purified的NLSm便拿去做LC-ms/ms 分析。結果質譜儀定出兩個可能位點:就是T513和T514(後來拿全長的K-RTA去分析也是定出這兩個位點)。先前Gwack(MCB,2003) 等人報導這T513/T154所在的S/T-rich region和負調控K-RTA的活性有密切關聯。因此我們就做了T513A, T514A, TT513AA的點突變株。但是根據luciferase(PNAp)和latency-disruption的結果發現這兩個位點磷酸化的破壞似乎和 K-RTA的生物活性沒有直接關連。猜測需要破壞更多的該domain磷酸基才能看出和wt的差異。

C) 同時,以phospho kinase-substrate software則比對出另一段和cellular NELF-B具高度相似性的區域。在這個區域中變掉2個胺基酸則大幅度降低K-RTA的分子量及活性(luciferase和latency- disruption)。

New on 6/2/2009:  D)CDK9 inhibitors抑制部分KRTA活性(但同時也會抑制S634A/S636A活性, 所以作用位點可能不在,或是不止這兩個Ser). E)KRTA S634A/S636A are both ubiquitin-modified.

小丸子: (1) phosphorylated S636 antibody seems to be a good one, 但要解決雜band問題.建議購買gradient gel看看有沒有辦法分開. (2)MG115抑制proteosome之過程可讓KR degradation減緩.

小丸子: Detection the amount of Ser/Thr phosphorylation in IP-purified KR, S634A/S636A and NLSm, suggesting total phosphorylation seemed to about the same among these three molecules.

小丸子: Confirmation of CDK9-KR interactions by Co-IP (機會來了,請繼續撐下去!).

Maruko: (1) 繼續奮鬥KR與CDK9 co-IP情形. (2)CIP處理過的KR, NLSm, S634A/S636A都可被p-T, p-S之抗體辨識. 懷疑either CIP 不完全,或是p-T, p-S之抗體不好.(辛苦你啦,又要IP又要CIP才能看結果,不簡單呀!)

Maruko: (1) 再度呈現KR與CDK9 Co-IP之鐵證. (2)探討KR與S634A/S636A差了近10 kDa是否因形狀結構不同所致?

Maruko: KSHV meeting行前rehearsal.

小丸子:整理S634D/S636D分子量、DLR activity及CIP結果.

小丸子:整理KR, S634A/S636A,S634D/S636D分子量、phosphorylation程度及CIP結果. 很接近終點了,加油,加油!

小丸子:整理KR, S634A/S636A,S634D/S636D分子量、phosphorylation程度及CIP結果.

小丸子:整理KR, S634A/S636A,S634D/S636D分子量、phosphorylation程度及CIP結果.

小丸子:報Paper (這裡), 有關reactivate EBV的四種方式. Great Job, Thank you~

小丸子: 以磁珠操作IP以證明KR與CDK9有interaction結果.

小丸子: Validate the expressions of AXL and EGFR in OSCC cells。Literature search of AXL, very good!

小丸子: Literature search of DDR1, very good!

2010/05/26 Lab Meeting 心得彙整 (未來目標)

小丸子: (1) shRNA knock-down PTKs in OSCC cells. (2) revise paper for another submission.

小丸子: 繼續shRNA knock-down PTK進度. Good Job!

小丸子: shRNA-mediated knock-down of AXL, DDR1, EGFR and FGFR3 in four Taiwanese OSCC cells. Beautiful results!

小丸子: Growth inhibition and Wst-1 assay of OSCC cells with PTK knockdown。

2008/09/16 Lab Meeting 心得彙整
小蓮:sip21/sip27 其實都蠻成功的.請再repeat一次這組實驗(去掉gapdh後共六個sample,seeding sample時細胞數目要算對,記住搖勻(前後左右,而非順/逆轉, wagada?)si轉染部份照舊,五個要加Dox,Dox加後6~9天內做綠染) Pusa bless you.

小蓮: Rapamycin對ERKV似乎有正向作用,黃老師建議思考mTOR可能是宿主細胞反制病毒活化的機制之一, 現在block住它,virus活化得較高興.這是很有意思的論點,要記住. siRNA繼續調條件中,HONE1補作ER實驗似乎okay. Slide做得很好(可是最後一張圖下方忘了加lane number,加上去就可與左邊說明相乎應). Good.

小蓮:HONE-1 transient transfection的rH2AX及actin待補齊,也期待paper被review得順利☺。 mTOR pathway對ERKV reactivation似乎是抑制作用而非加成。建議再跑一、二片新膠確定p70S6K有被抑制、KR/p21/p27/ER有沒有出來(用NTU的抗 體,因為1ng/ml的Dox24h可提引出的Rta可能不多。原來那片blot,請留給下週BioRad新機demo時用flag染,配套他們的超強 ECL試劑和儀器,看做得出來嗎)。 si-p21/p27部份保持這一次INTERFERin三天,然後dox三天的步驟(L2K同樣條件下似乎toxicity較強一些)。另一盤 duplicate留做老化綠染用(Good)。Hoeffer SE260請代為清點現有、賒借、欲加購的所有項目,謝謝。最後,ERKV靜置5天的lysate中flag-ER並沒有spontaneously lytic情形《註,旁邊是1ng/ml dox 24/48h結果,所以比較淡》。

小蓮:si- p21/p27部份以INTERFERin三天,然後dox三天的步驟做western blot analysis。 Dox-treated control組p21表現比siNeg還低,原因不明。綠染實驗仍在等待中…(那10/21那一批後來是怎樣的結果呢?好奇…)

小蓮：總 整理前面多次 siRNA條件(七、八次有吧,希望對你也有幫助,大力感謝)。基本上Ambion design的validated si-p21, p27都很不錯。搭配網路上廣作宣傳的siRNA transfection reagent, si24小時後加Dox那一組的條件應該是okay的。另外siNeg的怪現象看起來也是可以克服的。目前就是把新買來的染劑先確立可以染出東西,然後再 回頭做一次si24小時後加Dox的條件,不管能不能重複,這部份實驗就此完成。Rapamycine對KV似有一些加成功能,但是沒有dose- dependent,而且機制不明。這部份請把flag-ER/actin補完後,也是可以暫告一個段落。倒是趁 Flag-ER細胞還在時,來做一個reviewer建議的高濃度怎麼樣(100,200,400,800nM)?也是以10 uM的LY294002為control。

開始來問幾個問題,第一有病毒在時,cell也是停在G1嗎?有病毒在時p21,p27,CCNE,CDK4, CDK6, CCND1表現如何呢?在細胞核裡sub-cellular localization有沒有變化呢?

2008/12/16 Lab Meeting 心得彙整
小蓮:緊急 幫忙SFL做一組rapa的實驗給Prof. Misha Blagosklonny(第一次被外人國人主動邀請當collaborlator耶,要好好做!).主要是將rapa濃度提高,並加做 S6K(T389)及pS6(S240/244)之測試。TOR到底對病毒再活化是弊是利,加做這組實驗應該也會幫助瞭解.

小蓮:測試高濃度rapa對senescence之影響。

小蓮:設計實驗測試正常細胞和老化細胞的“胖度”差異;測試ER的細胞生理功能是否為可逆反應;ER對metabolic stress(=serum starvation)的反應以及U0126對老化的影響。

小蓮:以pS6證明即便是高濃度的rapa確實對ER-mediated senescence都沒有效果。(所以可否把今天報告的圖上傳至nas給我,謝謝)

小蓮：LY, rapa, U0126對RTA綠染之比較、著手irrversibility測試條件。

小蓮:(1) 有無serum 似乎對RTA induced綠染沒有影響(照相時有沒有辦法把大小、胖瘦、死活、真假綠染再分清楚一點?)。(2)準備細胞找出讓RTA表現可以被reverse回來 的點。(3)能否把張博士給的protocol和我們過去做的列在一起比較異同,下次在lab meeting中與大一家分享一下。因為日後會常以si來做functional assay,所以這個把技術非建立起來不可(附註:我覺得你過去做的其實也是成功的,只是我們看的點較長,而且又有細胞停在G1的影響)。

小蓮:U0126確實對Rta mediated growth arrest及senescence有明顯抑制現象(猜測一:Rta須靠ERK1/2下游的分子(ELK, Ap1 etc)共同執行功能;猜測二:Rta是ERK1/2的substrate!像這個)、繼續進行測試不同dox及時間對Rta reversibility之影響、幫忙理出siRNA protocol。(另外你早上提及ERK1/2與mTOR相關性在這裡,不過一般而言若上游的藥(U0126)有效,那下游的藥(rapa)應該也會有效才對)。

SFL3: 小蓮請注意,這次小丸子報告中,那個和U0126相似,卻還沒有達到effect的藥,是不是可以幫忙查一下劑量,看看是否也可抑制ERKV reactivation?

小夏3/26/09, 10:02 AM收到! 我偷偷染kv的綠染(5days)，幾乎每個細胞都綠ㄟ。

小蓮:(1) Ir-reversibility point for 293TetER is 5 ng/ml for 24 hr. (2) U0126 (10 micrograms/ml) inhibited three biological functions of Rta, namely p21 induction, growth arrest and SA-b-Gal staining. (3) M.W. decrement of Flag-Rta upon U0126 treatment (待查)

小夏: ER mediated KV reactivation is also inhibited by U0126.

小蓮:Flow cytometry analysis of Dox-treated 293TetER and EREV8; Western blot analysis of U0126/dox-ERKV.

小夏:與小丸子合作,第三次以flow cytometry分析代數較早之EREV8被dox活化後cell cycle分佈情形,但結果與前兩次並不相同,細胞有停下來,但是不會死.

小夏: Progress report on expressions of H2A, H2B, H3 and H4 in Luc/Rta/EV/KV/KR cells.

小夏: Progress report on expressions of H2A, H2B, H3 and H4 in Luc/Rta/EV/KV/KR cells.

小夏: Cell cycle analysis of Dox-treated EREV8 (完整版); PARP cleavage can be detected in virus-replicating cells. RFP/GFP可被methanol滅掉顏色耶!要來做一次看看嗎? (這叫永不滿足的科學家嗎?)

小夏:(1) 以 caspase 3 cleavage的western blot analysis證明EREV及ERKV中apoptosis的現象。(2)MeOH固定可有效 wipe-out (denature) GFP/RFP!著手籌劃ERKV的cell cycle analysis。但Phil提醒如此一來,細胞將變得較黏稠,宜以含FBS之PBS做往下之實驗。comments: (SFL) 這麼一說,我覺得是BSA才對.所以我繼混淆小夏&小嬿,CO2&liquid N2,藥品間&TC room後,又新加了一項痴呆紀錄.我完了。(小夏)OK~ I got it~ 謝謝學長的指教 感激不盡 (phil) I don’t remember I said FBS or BSA during the meeting. But 2~3% BSA in PBS should be working. Of course, FBS is definitely a good (and luxury) choice for blocking ^.^ 

小夏: 以methanol固定來denature dox-treated ERKV 中的GFP/RFP! ERKV的cell cycle於是大功告成 (太帥了)！

小夏: Cell cycle analysis of Dox-treated ERKV (最終話) – Good Job!

小夏: 偵測KR及OGlcNAc mutants 糖化情形. 293T似乎表現許多pLenti4系列質體所表現的蛋白質.

小夏: 偵測KR及OGlcNAc mutants 糖化情形. Flag-珠珠很好用,但input的量很難猜…

首先要謝謝小夏早上幫忙把眾人的細胞從僅剩二點多CO2的培養箱中救出.維修人員「保證」這次再有問題,他就….請太平洋氣體公司再來一次 (無言啊..)

小夏: K-RTA確實與PARP-1有交互作用. 因PARP-1所造成的PTM也是suppressive effect,所以目前結果似乎相當完美,希望能repeat這一個結果.

Hammerschmidt的新作在此.

小夏: 報paper: EBV/p2089 facilitates the tumorigenecity of 293 這裡 .

謝謝你們! Good Job, 希望自己也有收穫(不懂處,讚嘆處,崇拜處,不認同處..請多利用comment來討論,下年度我們幾乎都會玩到這些東西,所以講者聽者都可以踴躍發言)

小夏: Finalized OGlcNAc Fig 6. Great!! Thank you~

小夏: EBNA1及MN-trial 1: both not so significant in TWO3 and HONE1!

小夏: EBNA1及MN-trial 2: 時間延長至48h, 加入LMP1為positive control. Still not so significant in TW03!

小夏: Rta與ERK之關聯性研究一: IP-western之初步實驗結果顯示二者在293細胞中似有交互作用。Very good!

小夏: U0126在抑制Dox-treated 1B2也有效,往下focus在TWO1-EREVp2089,並加入TS, TS/U0126組別。

小夏: U0126對Dox-或TS-treated TWO1-EREVp2089之抑制狀況。(建議:下次這樣的data(濃度似乎和293不同,Flag-ER表現受到抑制)也可以報告啊,盡量不要重複已經報過的data。Introduction除外)

2010/05/26 Lab Meeting 心得彙整 (未來目標)

小夏: U0126是否抑制Rta-mediated EBV reactivation in TW01EREVp2089_S.

小夏: 報paper, Zta transiently aguments p53. 謝謝~

小夏: SA-b-Gal staining of TW01TetER #7, 16, 19.

小夏: Characterization of TW01TetER #7 and #19, part I: expression kinetics of Rta, MYC, CDK6, p53, p21, p27 and SFN by western blot analysis.

小夏:報paper。E-cadherin localizes DDR1 to cell junctions, which may prevent its contact with collagen, and subsequently eliminates DDR1 activity and DDR1-suppressed cell spreading.

另外，補充 E-cadherin negatively regulates RTK activation的一篇paper，abrogation of E-cadherin regulation may contribute to the frequent ligand-dependent activation of RTK in tumors.

Ingrid: (1) Preparation of GST-KR for polyclonal antibodies: protocol okay, 但把benzonase加入resuspending buffer中,而protease inhibitor放在第一次thaw完的lysate中,如果還是很黏的話要在thaw完後sonicate 15~30秒 (2)  366/367EE 有抑制現象!請再repeat一次,並且加入pFA-系列,如果也是抑制：(A) 以IP確認WT,366AA及366EE和HDAC1之interaction(we’ve bought this ab, didn’t we?) (B) 準備做WT,366AA及366EE在293/rKSHV.219之latency disruption (3) 293/綠EBV已槓龜兩次. (4) p21/p27與老化及many others: under control!

Ingrid:366/367EE有抑制現象, Cool. 需repeat pFA-TA系列及western（證明不是因mutant的蛋白質量表現得較少了之故).另外,可否找出先前我給妳讀的二篇paper?忘了是什麼跟Nat Cell Biol p53.謝謝.

Ingrid: (1) 366/367EE抑制現象,366/367AA活化現象無法重現.TK-RL,TK-hRL均出現不同實驗組不同數值之現象. (2) GST-Q658 is ready for affinity purification. 因lysozyme可有效打破細菌,所以freeze-thaw步驟可免. (3)NP460TetER, NP460TetKR部份請停下,毋須再suffer了,可能的話把精力挪到小嬿的clone上,她第一次screen,難免會手忙腳亂.

Ingrid:DLR western blot analysis沒有測出Flag-bands; pFA-GAL4系列質體活性測試(1:5+EF1-RL為internal ctrl)實驗已完成,等OrionL發完脾氣後才可得到實驗結果;著手進行7個T366及T367(含WT)全長的expression與DLR assay.

Ingrid: DLR 大部份okay,少數transfection到最後幾個sample都有數值劇降情形.建議找出可以”under control” 的盤數(是不是做到後來沒力了?).把有問題的再補做一次(那趨勢到底是怎麼樣呢?) Expression level實驗除T366A外幾乎完美,請繼續修補(ps1 slide上label這樣的T366A是看不到的,這樣的T366A才 清楚。隨時要體貼聽眾的眼耳鼻舌身意,利他做得多,是可以增長福報的; ps2注意我們paper上的圖每個mutant只秀一個clone即可)。KR的好抗體所剩不多,我們要加快做抗體的腳步,所以請幫忙找(A)有沒有 purify protein的地方?(B)如果給GST-clone,到做出rabbit polyclonal大致經費是多少?Thanks.

Ingrid: Antibody部份改以peptide當antigen.請幫忙尋價。謝謝。《結論:億康及亞諾法並行》。

Ingrid:Unable to purify enough GST-Q658 for antibody production,決定以合成peptide方式作為抗原來源。另外,能否請ingrid把白板上AB730的實驗步驟做記錄呢?是的,你的notebook寫得很好☺。

Ingrid:Thaw TW01Tet、HONE1Tet,準備塞入ER, gZ。DLR結果持續整理中(喜歡老闆加DNA及vortex的方法,哈哈哈哈哈…)

Ingrid: Performed 293/rKSHV latency disruption assays. OGlcNAc mutants showed increased activity in PANp-deRed.

Ingrid: (1)293/rKSHV 及 293TetR/rKSHV latency disruption assays 都顯示OGlcNAc mutant活性較wild type稍高(good! congratulations!)。 (2)不小心污染293FT, 重新製備ER與KR的lentivirions,預計下週感染HONE1TetR及 TW01TetR。 (3)委外的KRTA抗體製備順利進行中。(4)請協助小嬿的HONE1TetgZ and TW01GetgZ(我今年年初titrate HONE1及TW01的killing濃度是50~100ug就夠了耶).

2008/12/16 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:篩選TW01TetKR, TW01TetER,HONE1TetKR and HONE1TetER中。加訂KRS634, 636 phospho-antibody.

2008/12/23 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:第二次的KSHV latency disruption assay仍然看到O-GlcNAC對KRTA似乎是抑制作用!進行western-flag檢測transfection及下游基因表現情形。

Ingrid:以western測試KR+KROGlcNAc mutant disrupt latency之效果。

Ingrid：OGlcNAc對KR在PANp活性上具抑制作用(flow及DLR),可是對KbZIP卻又有正調控作用,why?

Ingrid:(1) 確定T366/T367 DLR之圖中…(2)確定T366/T367 Flow之圖中…(3)確定T366/T367 transient expression之western圖中…(4)準備重做HONE1TetER, TW01TetER, HONE1TetKR, and TW01TetKR。

Ingrid:整理OGlcNAc366/367T→A之結果。

Ingrid:Finalize T366/T367部份結果。

Ingrid:TW01TetER 繼續篩選中,強力禱告中…Screen時先點兩個slide,以IFA來看Rta表現情形,就是類似心瀅、小嬿做的那樣子。如果percentage太 低,我們就不要那個clone。所以western是在IFA後再做即可。另外請不要再tryTW01KR部份了(NPC cell並非KV的default host)。要的話時間拿來做HoneTetER. 謝謝。

Ingrid:九株 TWo1TetER以IFA(1:500)檢查 induction情形,二個好clone,三株空包彈,其餘induction rate不及50%, 後續將confirm size及growth arrest能力。小結:ingrid你果然對stable clone的養成殺很大!謝謝你!(如果7號和11號的size對,p21也有出來,我們就來請小嬿把EV及KV分別送入,一個月後就有名叫 TW01EREV及TW01ERKV的寶寶出生了耶)

Ingrid:Screening of TW01TetER (n=21),手氣極順,希望ER還是完整、有功能的。續以western及growth rate確定之。

Ingrid: Characterization of TW01TetER. Looks good, 下一步來送紅綠病毒進去怎麼樣?

Ingrid: Screening of HONE1TetER (#8, #5).

Suggestions from the audience and experiemnts in progress:

A】加做M2Flag IP-OGlcNAc Western, reveal the O-GlcNAcylation status of KR and O-GlcNAc mutants in 293 cells. B】加做M2Flag IP-4A4 Western, reveal the O-phosphorylation status of KR and O-GlcNAc mutants in 293 cells. C】Overall O-GlcNAcylation profiles in ERKV and TRex-BCBL1-KRTA. D】繼續以flow cytometry analyze KR 及O-GlcNAc mutant disrupt 293/KSHV之能力 .

重要:因為所須protein量多,所以scale宜大(至少半盤6-well palte).另外要記得放NCOAT inhibitor(GlcNAc)在lysis buffer中.

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1/12/2009 論文大綱:

A】 在293TetKR中所表現的蛋白質分子量與預期值(691*110=76kDa)及IVT做出的蛋白質 (98kDa)差異相當大,猜測K-RTA接受宿主細胞相當程度的PTM修飾作用。為瞭解O-GlcNAcylation是否參與其中,便以anti- OGlcNAc抗體檢測affinity-purified的KR,NLSm,ER,RR。

B】LC-ms/ms訂出K-RTA的O-GlcNAcylation的可能位點是T366和T367。

C】以三種功能測試系統(➀luciferase-PANp➁luciferase-TA➂latentcy disruption)來測試T→A及T→E的各突變株和野生種之差異,結果顯示O-GlcNAcylation對K-RTA的修飾應是具負調控的影響。

D】 BCBL1TetKR及ERKV中cellular Sp1和K-RTA被O-GlcNAcylation的kinetics相仿→均是先低後高,暗示著➀宿主細胞可能透過O-GlcNA來負調節所 modify蛋白質的活性➁被O-GlcNAcylation的蛋白質較穩定,不會被病毒reactivation時產生的proteasome系統分解 掉。

E】類似範例(待續…)

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10/23/2008

DLR 實驗可以finish-up了、六孔盤expression level也可以收尾,剩下disruption實驗請協助WHT尋找最佳target cell。Antibody製備改以peptide為antigen source,請幫忙尋價。NAS上有一份蛋白質序列請先下載,提醒我給你那兩段好的抗原序列。Thanks.

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10/3/2008 SFL wrote: 這是專給YCK的:題目訂為

Suppression of the Transactivation Activity of Replication and Transcription Activator of Kaposi’s Sarcoma Associated Herpesvirus with O-GlcNAcylation

在NAS上有新的圖檔,花了許多功夫把七月底的56MB檔案瘦身為39MB.但還是好大,我把它拆成二個檔,part1&2.請下載並幫忙補入新結果(圖檔請掃300 dpi即可)(餘待續)

Ingrid: OGlcNAc paper加作之實驗規劃與進度報告(notes: co-IP部份做HDAC1即可(lab已有antibody),recover BCBL1TRex-KR是為了看global O-GlcNAcylation變化)

Ingrid: Global O-GlcNAcylation status in ERKV and BCBLTetKR.

Ingrid: Kinetics of global O-GlcNAcylation status in ERKV and BCBLTetKR(苦痛即將離,請務必熬出頭~).

Ingrid: Global O-GlcNAcylation seemed to be dropped at the end of dox treated ERKV and BCBL1.（不好意思, 最近都沒時間關照你,下週應會有機會囉~)

Ingrid: First trial of virus yield in 293Tet/KSHV ectopically expressed wild type, T366A, T367A, 366dm, and 366EE.

Ingrid: Design experiments to help yang in selecting good expressions of FLAG-ER in TW01Tet cell lines.

Ingrid: Thaw 6 TW01TetER subclones for future studies.

Ingrid: 報Paper這裡. 口水裡的寶物/髒東西還真不少啊. Good presentation! Thank you~

Ingrid: 著手製備HeLaTetgZ/cZ/GFP, HONE1TetER/GFP, TW03Tet, CGHNK2Tet之偉大工程.這次包病毒可否考慮使用instructional manual中述及的方式,可提高3~4倍病毒量.

Ingrid: 走在最前→製備各種有用細胞株! 辛苦你了♡∞

Ingrid: Validate the HeLaTetgZ clones by western blot analysis。

Ingrid: 報paper:NP460hTert/EBV。謝謝。

2010/05/26 Lab Meeting 心得彙整 (未來目標)
Ingrid: Characterize TW01TetER #7 and #19, including (1) growth curve,doubling time, wst-1 (2) expression kinetics of cell cycle regulators between Dox 3h-Dox 72h. (3) OGT-1/NCOAT shRNA對KSHV reactivation之影響 (以HMEC-1/rKSHV來做)

Ingrid : Characterization of TW01TetER #7 and #19, part I: expression kinetics of Rta, MYC, CDK6, p53, p21, p27 and SFN by western blot analysis.

Ingrid: (1) 持續screen TW03Tet and TW05Tet。 (2) OGT antibody 測試中。

小嬿: 講得很清楚喔!知道已給妳太多paper了讀不完(sorry) 但是,可否,拜託,先讀一下這四頁知識,幫我們summarize 一下. 我覺得瞭解這篇以後,對往後妳和小丸子的實驗設計非常有用(才不會走錯路)因為這實在是太顛覆我過去的想法了!

2008/09/23 Lab Meeting 心得彙整
小嬿: (1)BC- 1及P3HR1的fuctional assay真的很有趣. 看來gZ及cZ都有function.tZ大概真的是一個Z的suppressor. (2)請密切注意Ingrid及小丸子的ratio測試結果,很有可能DLR中activator及reporter比一直以來都把妳教錯了! Sorry.

小嬿:(1) 多張slide空白處大於二分之一, 宜將內容放大.(2)promoter和transcription initiation site(箭頭處)要分清楚,尤其在解釋第一個實驗結果時,要將它們指出來,順便把三種status(Pol II stalls near the transcription start site, locates throughout the genes, and no Pol II)的分類帶出來.(3)最後作者是想做二個不互相抵觸的推論(A)Pol II pausing is for transcription repression(現象一,換成另一種mutantToll-rm9/10,那些在Toll-10b被抑制的基因就開始表現了,而它們原先Pol II pausing的狀態也都變成Pol II均勻分佈的狀態.現象二,snail是已知在Toll-10b中持續表現的一個repressor,作者發現接近60%被snail represses的基因也有Pol II stalling狀態)(B)Pol II pausing prepares genes for later expression (e.g. rapidly induction for hsp70, next-stage developmental genes including heart and muscle in the Toll-10b etc).(4)萬一這學期分數沒有上次高,都是我的錯,選了一篇太艱深的paper了…(先行懺悔去)

小嬿:EBV gZ DLR 實驗條件決定(activator:BHLF1-Luc(1:4), SV40-RL as internal control);請繼續titrate EBV R/DN1-Luc條件(internal control 為？);請幫忙歸納兩組結果(一)gZ等clone送入EBV+ve細胞中叫不出endogenous Z的Western blot analysis、(二)TPA及SB對PELs disrupt latency 的效果(請加入PWW那一張以及這篇的圖一). 下週meeting就報這二個結果.Thanks.

小嬿: TPA對EBV的Raji, B95-8, KSHV的BC3, BCBL1, BCP1有效,butyrate加上反而抑制。Butyrate對EBV的P3HR1(或稱HH514-cl16)及KSHV的BC1有效,TPA有時有 加成作用。另外,NAS上面有一張slide,是PWW以前做BCP1的結果(只有TPA和沒有NaB),請你把它加入你今天報告的slide中,以後就不用老是在心中掛念著這一件事。

小嬿: 成 功建立293TetgZ三株(B95-8strain),293TetcZ二株 (Akata strain),293TettZ (BC1 strain)四株。將進一步做較細部characterization (leakiness, expression level and growth rate)。Dox請處理48小時以上注意有無growth arrest現象。原則上試圖將maxi-EBV or Akata-EBV送入相對應的Z inducible cell line中。記得與懿宸學長學習(1)穿染Maxi-EBV至細胞中的方法(2)檢測culture supernatant病毒顆粒的方法(PCR of EBV-W)。謝謝。

Team-Wrok部份:經過各位連日來的辛勤耕耘,今天會和小嬿抽取一批小丸子prepare的sample,路過打招呼時請注意不要濺太多RNase給我們。3Q and good luck to us!

SFL去台北參加學生進度報告,所以沒有參加這次meeting。小嬿說 他報告三種Z 在B細胞中再活化EBV之功能(學長問及的問題簡答如下:tZ是由BC1 strain clone出來的,要問是否有negative regulator功能最好是回去同一種細胞裡,將full-length clone出來再做比較比較恰當。不過這部份目前不是我們的重點。會有這個發現是證明了小嬿具有明察秋毫、鍥而不捨的精神,並且也在磨鍊他cDNA cloning的功夫)。

小嬿：(1)EREV8 Dox、T、S、TS、gZ, cZ, tZ準備收尾(利用Akata Z > B958 Z之特性證明外送Z叫不醒endogenous Z;也想知道enodgenous R有被叫出嗎?) (2)準備下週測量EREV8/MaxiEBV viral titer事宜。(3)已pool三株293TetgZ,繼續培養293TetcZ,等有可用的infectious EBV,準備做EZEV。也想嚐試EZKV哩。(4)準備做HONE1TetgZ and TW01TetgZ. (5) Microarray data偷看中…等SFL借到軟體再好好分析。(你要做得完的話,我叫你超人,而且有賞﹍)

開始來問幾個問題,第一有病毒在時,cell也是停在G1嗎?有病毒在時p21,p27,CCNE,CDK4, CDK6, CCND1表現如何呢?在細胞核裡sub-cellular localization有沒有變化呢?

小嬿:著手測試由ntu來的4株293TetER_MaxiEBV是否可產病毒(再提醒一次,做出來一定有賞)。

2008/12/23 Lab Meeting 心得彙整
小嬿: Set up procedures for EBV viral particle detection.

小嬿:成功地建立出小量測量supernatant virion DNA的SOP.棒極了.SFL給妳拍拍手(學長們真是難以取悅呀,世界正在改變﹍).往下是來定有多少infectious particle.

小嬿:EBNA1 IFA測試,開始bioinformatics實驗(學Partek package)。一般而言,沒有入門課可上的話就是讀manual。心情放鬆,頭腦保持清楚,學做宅男宅女!

小嬿：以PBMC immortalization及感染293輔以藥篩兩個方法測試dox-EV8/ID4/3A5之infectivity.

陳P:練習用少量的錢、一個RA當酵頭,衝出一點好成績!亞鈴型拉絲雙核

BFB (breakage-fusion-bridge)、terminase、cytokinesis.

2009/02/03 Lab Meeting 心得彙整
小嬿:Survey of Z and EBNA1 expression in 293 cells infected with viral particles prepared from dox-treated EREV8 and MaxiEBVs.

小嬿:(1)測試EBNA1大寶2血清。(2)設立PCR-based titrating KV virion之系統。(3)準備測試EV/KV lytic replication所處的cell cycle stage.

小嬿:IFA調件測試、大寶2血清測試。

2009/03/03 Lab Meeting 心得彙整
小嬿:大寶2 EBNA1 staining成功!EREV8 growth rate結果確定。

小嬿: (1) Titration of viral particles released from EREV8: (a) PCR of encapsidatd viral DNA (b) EBNA1 (IFA). (2) Induction rate of EREV8 (a) Flag-R (b) ZEBRA.

小嬿:Induction of Rta, Zta and VCA expression in Dox-treated EV cells.

小嬿:PBCV1 vSET inhibits host transcriptome by global histone methylations.

小嬿:將p2089送入TW01TetER,放大篩選中.

小嬿: Progress report on Rta mediated transactivation of KV promoters.

小嬿: Characterization of TW01TetER-KV clones. None of them can be reactivated by Dox (有二個可能原因(i)能被活化的早在infection時被留在viral sup的少量dox搞砸了 (ii) TW01TetER中,ER表現量不足.

小嬿: Review of 293Tet_Flag_SOX and its EIK mutant. Thanks.

小嬿:〝determination of EREV8 induction rate by IFA and flow cytometry analysis〞出師記。

小嬿:Progress report of TW01Tet/rKSHV.219 : (1) can’t be reactivated by either Dox nor TS, (2) TW01TetER clone 7 has effects in the down-regulation of CDK6 and phosphorylated Rb.

小嬿: Determination of virus titers for EV and KV cells – 不好做的重要實驗,請加油,很接近了呦!

小嬿: Determine the virus titer of ERKV. 以1:4稀釋virus sup的條件下, flow cytometer及肉眼均可用來計算infectious unit. 惟flow cytometer似乎比肉眼高3~4倍. Good.

2009/11/24 Lab Meeting 心得彙整
小嬿: Determine the virus titer of ERKV. 以1:4稀釋virus sup的條件下以肉眼計算.完成三次平均值的實驗. Flow部份暫時擱下, control組background很高.

小嬿: 確 定不發光的EREVp2089、TW01EREVp2089中EBNA1是否還在. Viral genome的stability是目前YJC最care的事,加油! (報告得很清楚喔→你才一講完,大家就紛紛地說出你下一個步驟應該怎樣怎樣、是不是可以用xxx取代xxx云云)

Hammerschmidt的新作在此.

小嬿: 報paper: EBV進入B細胞和上皮細胞後,命運不相同.. 這裡.

謝謝你們! Good Job, 希望自己也有收穫(不懂處,讚嘆處,崇拜處,不認同處..請多利用comment來討論,下年度我們幾乎都會玩到這些東西,所以講者聽者都可以踴躍發言)

小嬿: (1) 報paper: EBV 在鼻咽癌細胞中遺失過程.這裡. (2) 整理EREVp2089, TW01-EREVp2089之進展. Great!! Thank you~

小嬿: PCR detection of EGFP and Hygromycin genes lost in EREVp2089 #B2.  EBV induced GI in LCL. 這裡 已email EBV及phil.

小嬿: TW01-EREVp2089 clone #3 的subcloning. 共挑11個pure, green colony, 可惜只測到Z, EA-D起不來, 目前原因仍不明白.

小嬿: (一)補齊paper圖一之western blot analysis, 水喔。 (二)EV titer部份,決定先放棄IFA法測試Z或EBNA之表現,改以q-PCR來訂定medium中virus particle之釋放量。

2010/03/30 Lab Meeting 心得彙整
小嬿: 整理報告建立TW01-EREVp2089_Fast and Slow之過程. 好棒! 妳的細胞株一定會有許多人想要的 (要不要來patent? 哈哈,想paper比較要緊)

小嬿: (一)補齊paper圖一之virus particle kinetics。 (二)確定TWO1-EREVp2089有infectious particle 產出。2010/05/04 Lab Meeting 心得彙整

小嬿: 報paper:LSD1對HSV1/VZV immediate-early gene promoter上H3K4/H3K9之影響。Thank you~

小嬿: 報paper critiques.謝謝大家的鼓勵.We can make it!

2010/05/26 Lab Meeting 心得彙整 (未來目標)

小嬿:(1) 293/rKSHV.219與BC1中KSHV latent genome被Rta活化情形. (2) EREV8 及 ERKV viral particles之titration,以及其中Dox 96h infectious unit之訂定. (3) 以Na-butyrate及Dox處理EREV8細胞後,Rta與Zta之表現程度比較.(4)expression kinetics of cell cycle regulators between Dox 3h-Dox 72h in 293TetER, EREV8 and ERKV cells. (5) Latent genome copy number in EREV8, ERKV and TW01EREVp2089_S and _F.

小嬿: Expression kinetics of cell cycle regulators in TW01-EREVp2089_F and _S.

小嬿: 彙整Rta-mediated cell cycle arrest vs EV/KV reactivation kinetics。 Good and Thanks。

小嬿: 彙整(1) Lytic replication “throughput” in TPA/Butyrate- versus Dox-treated EREV8 cells. (2) Raji EA-D inducing unit assay. (3) Dox 96h-1A4: viral particle (~0.78 M / ml), 其中約6%可感染Raji而3%可感染293。 Good and Thanks。

小嬿:討論cell cycle analysis Flow的詳細步驟。

小嬿: 報告Vieira新作：(1) keratinocyte (角質細胞) vs. epithelial cells (上皮細胞) (2) keratinized vs. non-keratinized (3) simple epithelium vs. stratified epithelium. 哇，SFL覺得這部份實在有必要再回去讀教科書一下，越讀越複雜？！

On Sep-16-2008 AM 10:00, SFL wrote:
Dear All, 陳老師在上週三院務會議後,熱切地吩咐我要把Rta造成MN增加的現象(楚穎論文)再加幾個圖(仿常申之paper)希望Int. J. Cancer這一篇被接受後,能夠把Rta對GI的contribution由我們Taiwan人自己發表(餘略)
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三個成見(二不一會):
1. Rta’s function in the cytoplasm is NOT considered here.
2. Rta-mediated MN formation in cells during EBV lytic replication may NOT contribute to NPC tumorigenesis, because cells may die before MN are formed.
3. Rta does lead to MN and rH2AX formations in EBV-ve cells.

Rta, AKT/ERK and G2/M:
(1)歆蘭,勝彥,楚穎以及現在旻潔都提到Rta對M phase的加速離開有 貢獻.但是SFL詳讀楚穎論文圖七,八,九後覺得是否有可能表現Rta之細胞要進入M期受阻,所以在施以thymidine或nocodazole這類同 步化步驟時,M期細胞總數就較control組少(鐵證:圖九(B)中有Rta的細胞在0點時, CCNB/CDK1/AuroraB等M期蛋白均較solvent control組少),導致解除同步化後M phase加速離開的假象.
(2)同 理,會不會ERK1/2在某個時間應是被shut-down的(如圖七(B)solvent control r6, r8),但是有Rta時這個checkpoint的到達非常不容易,因此有Rta表現的細胞ERK1/2都是on著的,所以總量以western blot analysis分析時就較control組高.

要釐清這二點的話,應該:
(1)請再提醒我一下除了看M期各蛋白提前消失外,還用什麼方式證明Rta對M phase的加速離開有貢獻.
(2)現在旻潔double thymidine block的實驗中(陳老師說已非常完美),能否以flow驗證一下圖七(B)下面那個表格的實驗,看看release後每個週期的細胞群比例.

再來是讀完paper和聽到大家的實驗結果後的感覺與猜測:
(1) 當Dox一加,Rta被誘導出來後,p21/p27等等regulator跟著就被誘發出來/抑制下來(在transcriptional level).細胞受到這些”cue”所產生的表象就是緩緩地進行細胞週期:其中一些被迫停在G1,這些細胞S phase所須的材料都沒有準備好,因此無法繼續前進.能夠前進的則進入S phase,開始做DNA replication的工作,做完後進入G2,準備M期所需材料.之後依前類推凡是能突破checkpoint的就往下,不能的就等待.所以若能將細胞 同步化在某一點,release後以flow分析,有Rta的那一組,每個細胞週期的細胞數比例會與對照組不同,而這時候依照cell cycle變化,就可以說明Rta在HEp2中雖然無法讓細胞停住不再分裂,但是因為Rta及其衍生物擾亂了每一步驟的進行,而使生長曲線變慢.
(2) 可能是細胞的不同,293TetER是明顯地被停在G1 phase,但是HEp2TetER則是doubling time由24變51小時.這裡我的一個疑問就是:在這由1X變為2x的51小時當中,究竟是大部分有Rta的細胞都放慢腳步在複製,還是這個 population中有部份細胞Rta掉了,所增加的細胞數其實是來自這部份的貢獻.有沒有辦法區分這兩者?有用IFA做過Flag-ER在 HEp2TetER/Dox的陽性率嗎?另外一點隱憂就是,當我們在passage細胞時,其實許多cell surface molecules會傳遞訊號進入細胞內.所以對一些已被Rta及其轉活化產物作用到某一程度的cell,當你以”盤子滿了,得passage!”的步驟 處理後,細胞肯定又加入許多signals,說不定reset所有之前Rta及其轉活化產物所累積的”功德”.這一點要想一下怎樣control或是證明 沒有effect.
(3)Akt/ERK1/2的持續活化應該是來自於Rta/Rta轉活化產物的共同效應(you can not agree with me more, right?).這些點找出來paper就有了,Rta促進MN產生就有機制了,晚上睡覺時就不會覺得好像哪裡不對勁..相反的不管這些點硬要說Rta在 細胞質裡somehow activates ERK1/2, AKT,p38,JNK…或是Rta表現somehow促進MN產生而造成NPC GI,這些都有點偷岬步令我無法信服(I can not agree with them anymore).
(4)According to陳老師,這些data最好是速速整理成論文發出去,被PRC搶先發表他會很難過的.通訊作者是許老師,第一作者未定.我個人頃向由勝彥,楚穎,旻潔協調出一人來.主要菜色建議這樣端出來:

Title:EBV Rta induces MN formation in HEp2 cells.

(Figure 1):Rta increases the doubling time of HEp2TetER from 24 h to 51 h by delaying the progression of cell cycle in G1,xx and yy, while promoting the exit of M phase (真的嗎?).
(Figure 2):Constitutive activation of AKT, ERK1/2, and xx signaling proteins are observed in Rta-expressing HEp2 cells.
(Figure 3):MN formation is dramatically enhanced in HEp2 expressing Rta (全上囉,圖啊,表啊of bi-nucleated, multi-nucleated, mis-segregated,以及日後的karyotyping)
(Figure 4):Rta-associated MN is mediated by ERK1/2 signaling pathway (U0126)
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of M phase pre-exit(論文圖八圖九), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of p21’s interference in G2/M(楚穎的救命寶), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of constitute activation of ERK1/2(by DUSP3 or BRAP2最好不要是這個), or,
Figure 5 and more:newer results and corrections from 各位!
加油了,米那桑,把走過的http://eln.nhri.org.tw/lims/?q=node/1607/edit留下一點痕跡吧!

我的翻譯是：妄想紛飛是不快樂的來源。這裡。我記得corresponding author常常在Dalai Lama的書中出現，是位在哈佛大學從事認知科學的先驅！

PLoS ONE的rebuttal pdf 已上傳至nas，有興趣者請自行下載。

…釋迦牟尼佛在《法華經》裡說：「是法住法位，世間相常住。」任何一個現象都有它的位置，範圍與特性，毫不混亂，世間相就是這個樣子，亦即在日常生活 中，我們看到的所有一切現象是法，而法之中有全體的法與差別的法，但是差別的法並沒有離開全體的法；每一法各有各的範圍和特性，而一切法也都有其共同性， 在統一的和諧中，不失個別的差異現象，即是法住法位。by 法鼓山聖嚴法師

希望我們抬頭望到這句偈子時，別忘了讓手中正在研究的題目、操作的實驗均能 法住法位、各安其所。心中的思想也是。並恭賀大家 平安順事 春風得意！

下一步就是弄清楚Rta是怎麼樣一次動到這麼多基因。這一篇我們就可以有完全的主導權囉~ 萬歲！終於擺脫EV/KV互剋、Rta促進pRb degradation的糾纏…謝謝小嬿替Lab Set-Up許多相關的實驗步驟。也恭喜小嬿!!

請印出自己的pdf核對一下。我想應該有不少地方是打錯的。請於更正後再還給我來為各位修正! 謝謝大家~

剛剛問了夏老師有關他們和陳Ya-Wen老師家的Journal Club, 是隔週的星期二下午3到4 點開一次。最新一次是4/12 。Paper可以自行挑選，但須於一週前告訴聽眾，好讓大家有時間讀一讀，參與討論。小丸、Ingrid、小夏我們報名去參加好嗎？夏博說其實雙週才開一 次，久久才輪得到一次，而且人多討論才熱烈。所以很歡迎我們去加入耶！(小嬿的話可能還得和陳老師商量一下)

有一段時間我曾經安排每個人每週有半小時的時間，上來office和我討論實驗。後來為什麼停掉了，有誰還記得嗎？即日起，如果有人有需要的話，我將開放星期四下午二點至四點的時間討論實驗。意者歡迎上來討論討論! 不過，希望每次還是以半小時為限，thanks。

上週末Bioruptor業務幫我們把儀器fix好的同時，也提及許多Lab在置備protein extract的同時，現在都會加一步sonication的步驟。

set at “Low”, 5 cycles.

據說這樣才可以充分地把胞膜上面的蛋白質都萃取出來。有做膜蛋白的人要注意一下! 非膜蛋白的人也可以試試看多加這一步驟，protein是不是萃取得更完全。