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小嬿的私房菜:1)ER對CMV-RL有50%抑制、對SV40-RL有66%抑制、對TK-RL有5倍活化能力,因此推薦EF1-RL為internal ctrl。2)gZ對SV40-RL有2倍活化、對TK-RL有4~5倍活化能力。3)KR對SV40-RL有80%抑制、對EF1-RL有異常高倍活化能力,因此推薦TK-RL或-hRL為internal ctrl。————————————–09/30/2008 Lab Meeting心得彙整Dual Luciferase assay: 所以,測試結果簡述如下.(1) Internal control: pFA-GAL4系列因KRTA/TA在40ng/well/24-well plate含有約1K~2K的內生性renilla luciferase活性,而vector control pFc-dbd當初卻沒有clone進去這段活性,所以最後選擇以值最高的pEF1-RL為internal control(約一萬)來蓋過KRTA/TA的basal level.(2)pLenti-Flag系列因pEF1-RL在不同activator:reporter比例被活化的程度不一, 所以選擇以variaion較少的pTK-RL或pTK-hRL為internal control.(3)以後操作DLR的SOP:第一步,找出哪個internal control不會被你的activator影響,這個數值代表的是你的每個well間transfection,passive lysis,到DLR assay這些步驟的一致性.當這個值高高低低(加減10%以上)的時候代表若非技術還待磨鍊,就是其它東西會影響這個internal control的表現量或活性,而這時候去思考firefly/renilla是…愚蠢的.第二步,activator/repressor對responsive elements常有bi-phasic mode,就是量在一個區域內是線性上升,可是在另一個高一點的區域內又會成線性壓抑(好像小富翁與大富翁對照快樂係數的比例,個人覺的一億台幣是那個分界點…ㄟ怎麼會談到這個?)所以像這次Maruko和YCK做的不同比例測試的前置實驗是需要的.Maruko:全長KR之DLR以TK-RL或TK-hRL作為internal control均可(ps.SV40-RL會被KR抑制80%活性,而EF1-RL似乎被瘋狂活化);IP進行中;latency disruption籌劃中.小嬿:(1)之前結果顯示EBV Z對SV40 promoter會有二倍活化,對TK-RL(or)TK-hRL有4~5倍活化.(2)以SV40-RL為internal control下,證實gZ,cZ可活化BHLF1-Luc,tZ is non-functional.(3)以electroporation方法證實gZ,cZ可活化p3HR1中EAD,但是endogenous Z好像沒出來(a梗?). (4)293Tet_gZ(3 clones), 293Tet_cZ(2 clones), and 293Tet_tZ持續放大篩選中.(5)下星期被吩咐要報RNA pol II pausing的paper所以(實驗進度就免了).建議實驗:(1)EBV Rta與Zta的transient-transfection實驗,仿小丸子和YCK上週做的2:1, 1:1, 1:5, 1:11條件,看看EBV Rta與Zta對其direct-binding promoter之behaviour是否相似?(2)P3HR1那一組blots,雖亂,考慮檢查endogenous Rta是否有被叫出?(用NTU ascites那一管)Ingrid:Protein purification進行中;DLR western blot analysis 進行中;pFA-GAL4活性測試條件決定,其中366AA絲毫不差地repeat了PWW結果,366EE亦上升,暗示OGlcNAc修飾會壓低TA活性.另外,全長,各clone表現量與latency