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5/2 Lab Meeting-ingrid

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1.製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體 (1) pGEXHis_cZ :已分裝保存於-80℃冰箱。可用於WB(1:2000)(萍)、IFA(1:2000)(鏸)及免疫組織染色 (1:1000)(鏸)。(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop : Q320stop已送給濁水溪代製。另外構築pGEXHis_ER_277E-516V做蛋白質表達。(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop :蛋白質表現量太少(失敗)。(4) pGEXHis_BALF3 :蛋白質表現量太少(失敗)。 2.使用EGFP當目標基因來測試建立NP460TetR_ER inducible cell lines的條件：用未稀釋的lentivirus病毒液直接感染6小時後移除，細胞發綠光比例接近100%，之後細胞放大後，使用10 ug/ml zeocin作篩選16天，發現未加Dox與有加Dox的綠光比例類似，建議做WB(flag)作確認。 3.萍使用Mini-PROTEAN II multiscreen apparatus (Bio-rad)來進行抗體最佳稀釋倍數的實驗。相關資料在https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/f9ec3085-b590-44c6-9b36-b36876cad466/Mini-PROTEAN_II_Multiscreen_Apparatus 首先置備只有一個well的膠體，樣品量為單一well*20=200ug (萍通常使用量)，轉漬完的NC膜置於裝置內，略將裝置傾斜後，從下面的孔注入600ul抗體稀釋液(避免氣泡)，室溫靜置2小時後，以Tip移除抗體稀釋液，用TBST清洗3次後，將裝置打開把NC膜拿出，進行後續二抗的雜交實驗。

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Rta/p21/Senescence/Tumorigenesis

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IB Roninson pdf 1605, 1624 in Bound Book (Senescence 3/3) PDF 1624: Short-term expression of p21 led to rapid downregulation of genes involved in mitosis and DNA replication. However, a longer-term consequence of p21 induction resulted in the induction of multigenes (PDF 1605), many of which are involved in aging as well as secreting anti-apoptotic

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0409 Lab meeting-蔡小丸

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1. 將DDR1 IP後的interacting proteins (no. 1-4) 切下後訂mass, 而no. 1約60 kDa, no. 2約75kDa, no. 3約85 kDa, no. 4約160 kDa的蛋白質, 其中最有興趣在一些OSCC細胞中可能有高度磷酸化的區域為no.2 利用MASCOT分析的結果統 整出較有可能的protein分別為 Heat shock 70 kDa protein 8, Heat shock 70 kDa protein 9 及 Polyadenylate-binding protein 1, 這些結果進一步需實驗進行驗證2. 利用OEC-M1處理Glivec後, 觀察抑制DDR1活性對OEC-M1的影響 結果發現細胞生長停止, 但細胞死亡的情形不明顯3. 觀察K2及K6細胞對Glivec的敏感性, 結果發現Glivec對於DDR1表達量較少的K2的生長抑制效果較差, 此結果仍須重複確認

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Let’s Move On!

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4/10 SFL wrote:Sorry FYC, 多兩篇給你! (ref new 1), (ref new 2)。另外, 下面的ref 3–7你可以先忽略不必看。—————————- 恭喜小丸子、Ingrid得獎!!也謝謝小夏、小嬿的努力，我們和knicks一樣→work as a team，個人獲獎就是整個team的榮耀! 所以請客這種事就是老闆出錢、夥計們出力就對了! 往下大家(包括FYC)的目標調整如下: 1. 要present的圖，包括平日lab meeting均要run一下統計。 2. EBV related: (a) Infection of NP460hTert with Akata-GFP EBV  (ref 1, ref 2) (b) Rta-mediated genome organization (ref 3, ref 4, ref 5, ref 6, ref 7)。3. Oral cancer related : (a)

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03/28 Lab Meeting- 小夏

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目前的工作: To determine the DDR1 mutations in 7 OSCC cell lines. Note:The external gene-specific primers and internal M13-appended PCR primers for activation loops and JM domain (Ref.1)(Ref.2) 這兩篇的mutation都與drug的sensitivity有關。 我稍微追了一下Ref.2: Cancer Cell 2005這篇以High-throughput DNA resequencing 在164 polycythemia vera病人當中的121位有 JAK2V617F missense mutation，其中41位homozygous mutation; 80位 heterozygous mutation。Homozygous mutations來自於mutation allele的duplication。這篇的貢獻在於Inhibition of the JAK2V617F kinase with a small molecule inhibitor

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未來的實驗計畫

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1. EBV RTA Ab(1)我自己做會再試試Rosetta-gami2，不然就要換其他plasmid—我看我老公論文換plasmid後，表現量有差 (同時濁水溪丁先生也是這樣建議)。(2)濁水溪丁先生來看過WB結果，說把ERQ320 plasmid拿回去純化試試看 (若不成功不用錢)，已經將plasmid給他，約估花2-3禮拜。 (3)基龍米克斯也有蛋白質純化的服務，他們公司的post-doc可以幫忙試不同plasmid X 不同compentent=一個條件8000元，不成功(蛋白質產量未達到0.5mg/L)的話要2500元(試劑費)。 2.Zta Ab抗體純化(1)proteinA/G純化—丁先生說通常是延長抗體保存期限，我們保存在-80度應該OK，不過丁先生也不敢一定保證。(2)antigen column—可提高專一性，但若用(1)純化可得約10-20mg/20ml serum，但用(2)可得2mg/20 ml serum (應該還是會有些抗體掉了) 問過萍學姊，他建議我用NA/TS在做一次，因為他用的是EREV/Dox，本來就會大量表現ZTA，看是不是也是1:5000的稀釋條件是OK的。 PS 萍學姊說他們實驗室都沒有純化抗體，只有應reviewer的建議純化少許抗體作實驗。 3.NP460htert (是不是要先等FY決定題目)現在實驗室剩(1)DKSFM+Epi:在去年年底混和好，目前剩有回溫過的150ml+在冷房的200ml (7266元/1L，約等貨14-20天)(2)KGM-2在20111025購買500ml全新未拆封—冰箱有20ml之前留下來的 (10000元/1L) PS(1)有看過宜津的DATA是建議2ng/ml TGF-B作實驗=Dr.曹做NP460_EBVakata的條件(2)小夏當初TW05EREV—PEG濃縮病毒可以明顯提高感染率，但TGF-B只有一咪咪

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