RNA Polymerase II Pausing 的延伸閱讀
歷史背景介紹(before 2005):1986年Lis實驗室首先發現以chromatin immunoprecipitation (ChIP)偵測RNA Pol II在果蠅Hsp70 promoter(hsp70)的結合位點時,發現雖然還未被heat induction,但hsp70上卻已有Pol II binding.他們進一步以KMnO4 footprinting和nucear-run等解析度較高的技術算出,在未被heat shock的hsp70上 面Pol II結合位點集中在transcription start site下游20~50 nt附近(+20~50).這種RNA Pol II停在+1下游40 nt左右,而且不再往前polymerization的狀態稱為promoter-proximal pausing.因為hsp70被heat shock後transcript的合成的上昇速率高達100~1000倍之多,因此當初認為這應該僅僅是少數的特例之一.在mammalian cell中較為熟知的類似例子有三,分別是c-myc (1992), c-fos(2006), 和junB(2006). Pausing 的另一種含義是elongation受阻,在in vitro實 驗中發現,若加入positive transcription elongation factor b (P-TEFb)那pausing的現象可被大幅解除.P-TEFb是由cyclinT1和CDK9組成.其中CDK9扮演的角色就是 phosphorylate停滯在promoter-proximal pausing上的三種成份:(1)Pol II CTD上的Ser5 (不知道是不是52個repeat上的S5都會被modify) (2)negative elongation factor-DSIF(磷酸化後的DSIF反而變成positive ELF,會與Pol II緊密結合在一起,直到做完transcription後,一起跳海) (3)另一個negative ELF complex叫NELF(由A,B,C/D,E四個subunit組成,磷酸化後的NELF會掉下來,是一個正港的negative elongation factor!) 病毒界有兩個蛋白質是透過與CDK9結合/增加Pol II的elongation及processivity,以彰顯它們transactivation的能力,那就是Tat (HIV) and VP16(HSV).
(正文)2001~2005 年間,tiling-chip在小型genome上成為可行/負擔得起的技術,針對每個基因哪裡到哪裡是它的promoter, transcription start site, splicing site,termination site等等資訊息都很清楚.另外在這段時間內各個物種的transcriptome也已被分析得相當完整.而有關RNA Pol II pausing 的相關研究,首推Bing Ren實驗室發現人類fibroblast genome上,約有5%(~650)的基因具有transcription machinery結合,但卻沒有transcript產生(2005)。 Richard Young實驗室接著發現人類胚胎幹細胞中(embryonic stem cell),也是有許多基因具有Pol II,acetylated H3,H3K4me3等活化marker,但也都沒有transcript被生成,或是具polymerase elongation特有的記號H3K36me3(Jul-2007)。 另外,結合ChIP及tiling chip技術,同一個實驗室在果蠅胚胎突變種Toll10b的genome中發現原來這些不表現mRNA但卻有Pol II結合的基因(~12%,1,614 of 13,448),Pol II大部份被發現停留在+40左右,也就是典型的promoter-proximal pausing狀態(Dec-2007,小嬿seminar paper)。Side-by-side發表的另一篇文章是採用果蠅胚胎細胞株S2為研究材料,這次他們發現約有8%基因有promoter-proximal pausing(Dec-2007)。 綜合對果蠅胚胎發育各階段各基因扮演的角色,和它們expression kinetics的瞭解,這幾個實驗室提出了二個Pol II pausing可能的生物功能(一) active transcriptional repression (二) preparation for rapid activation at later stage of embryongenesis or environmental stimulation.第二種可能性已被今年發表的二篇論文驗證.第一篇發現一半以上有NELF binding 的pomoter其實是屬於可被induction 為high-expression level的基因群(May-2008). 另一篇論文將NELF-B及NELF-E以siRNA方法knock-down後,發現許多基因的表現不升反降,暗示著NELF這群negative elongation factor可能是透過停滯在promoter-proximal site附近,以保持該區chromatin structure處於可隨時被P-TEFb等分子turn-on的狀態.所以許多stress responding gene均可見及Pol II pausing(July-2008).最後這一篇則歸納出promtoer上常見的pausing button(June-2008).
(臆測點1)剛開始吸引我注意的是,NELF-B(Entrez叫它COBRA1)C-端有一段SPSP區域和KRTA的S634~652間非常相像.這種序列是典型會被CDKs磷酸化的位點.雖然Maruko和我不約而同以類似的program猜想五號CDK是最有可能的KR kinase,但現在我想改投九號一票.因為(1)NELF會被P-TEFb(cyclinT1+CDK9)磷酸化而離開pusing site,讓Pol II 往前走; (2)前面提到的Tat和VP16均仰賴CDK9而彰顯其活性; (3)KSHV有一個latent時期表現的gene叫cyclinK ,也被發現和CDK9結合而磷酸化p53上的Ser33.
(臆測點2)為什麼所有的gamma-herpesvirus都用RTA來做latent-lytic switch呢?為什麼RTA/TA domain那麼potent(幾乎贏過所有已測試過的cellular transcription factor的TA domain)?為什麼把RTA家族的a.a. sequence line-up後,大家最相似的部份是在N端DNA-binding domain而非C端的TA domain(可是彼此之間又不能互相swap,互相reactivattion?像ER只認DN-Luc,p21-Luc,而KR只認PAN-Luc, ORF57-Luc)?最棘手的是ER的RRE和KR的RRE都非常degenerate。就算是透過其它結合蛋白來和DNA做contact,二者所依靠的結合蛋白也應該是非常不同。如果把RTAs想像成chromosomal remodeling這一類的蛋白,那它們調節viral gene表現的機制是不是較容易解釋。像小龜加入doxHEp-2TetER後,不到1小時p21表現量就激增;小蓮的細胞老化實驗也顯示,某些基因是同 時被活化、而某一些又是同時被抑制。還有觀察ERKV、EREV8被dox活化,其中一些IE/early蛋白的expression kinetics也是那種一炮衝天的情形,好像前頭有什麼瓶頸似的,現在終於衝破了。那個瓶頸是什麼呢?會是像hsp70被Pol II pausing的狀況嗎?(shouldn’t be Flag-ER, cause its expression peaks at 6 hpi, and maintains a stable rate thereafter)
(臆測點3)那麼來看看兩個immediate-early promoter,EBV BRLF1, BZLF1及KSHV RTA, KbZIP(我仿照前頭的寫法,蛋白名稱斜體就是表示該蛋白的promoter)。發現ZEBRA的Jill Countryman最近有一篇J.Virol,非常詳盡地描述BRLF1,BZLF1在接受到這類chemical刺激時,上面histones acetylation的變化情形(Jill是我的美籍學姐,老公是律師,家境優沃,做science是她的興趣,中午一杯yourgot搞定。曾被她唸過一邊聽人演講一邊看自己手上的paper是非常沒有禮貌的行為,從此改掉這個壞習慣)。HH514-16(clone 16)是P3HR1衍生細胞株,可被NaB提引出lytic cycle,但TPA則無效。她發現以三種不同的HDACi (NaB, TSA, VPA)處理clone 16時,BRLF1上的H3,H4均會被acetylated。也就是說Rta的promoter region可被這三種HDACi解開。但奇怪的是,只有NaB和TSA可induce lytic cycle,VPA則不行。好,下一步她反過來用B95-8/Raji這組細胞來做。B95-8/Raji可被TPA或5-Aza-C induce lytic replication,但是HDACi則無效。有趣的是,雖然TPA treated的B95-8有在做lytic replication,可是它的BRLF1/BZLF H3/H4部份卻不見被acetylation。綜合上述兩種結果,BRLF1/BZLF的acetylation與否似乎和走不走lytic cycle無關。那麼,和RNA Pol II pausing有關嗎?(今天有新鮮貝果在後面冰箱,只有讀到這裡的人才知道)。
1. 怎麼覺得COBRA1這個蛋白好像在哪裡聽過? 挺熟悉的…是不是在某張microarray上看過? (完全是murmur…)
2. 還有,如果歷史背景介紹有圖就更好了…(是不是像這樣的? http://www.nature.com/nrm/journal/v7/n8/fig_tab/nrm1981_F2.html)
3. 真是一個幸福的實驗室! 不過貝果如果有cream cheese或果醬來配就更棒了…呵呵~
1.嘿嘿,不好意思,真的是你在的時候就對出來了(可是最近想要repeat 都做不出來 是名符其實的”明牌一張”).COBRA1一直沒人做biological function,因為照字面翻譯是BRCA1的co-repressor-沒啥搞頭.但是,NELF-B就有一堆paper了,相見恨晚.
2.我是買素的cream cheese,記得你上回買過別種口味的,好吃嗎?連續假期的第二天,覺得竹南好冷清,所以殺回去之後就去Costco沾沾人氣.沒想到人多到爆,又後悔聞到那麼多的汗臭味..(大大阿姨要慈悲一點啊)
dear學姊
我研究了一下paper附的LM-PCR primer
一個基因有三個primer, 且有互相重疊的序列,
跟database的基因序列比對的話, 以rho gene來說, 這三個primer的序列會對上rho gene的第一個exon的3’端
而5’端of gene是接上linker A+B(linker B較短, 是可以完全重疊上linker A)
PCR過程(after KMnO4 treatment)以linker 序列和三個specific to 3’端of gene的primer做PCR
不管T斷在哪裡都可以用這個方法PCR出來
若T在+1的位置(假設exon 1長度為100 bp)則可PCR出99+linker的size,
若T在+50的位置, 則可PCR出50+linker的size
在跑膠之後, +1的T因size比較大 所以在上面, 而+50的T則size叫小, 所以在下面
這樣推論 合不合理?
又
一個基因的3個primer
經過nest PCR 應該會產生那個size最小的product
且固定3’端的primer, 不會產生兩端都有T-residue斷的產物
超級合理的耶!你會紅.
Flymove有清楚的17個stage說明.ImaGO確實是以in situ hybridization去分析2,179個gene在這17個stage之表現情形.KMnO4 footprinting可考慮使用這張的圖解。
小嬿,如果我想看EREV8中Zp,ERKV中Rp是否有Pol II pausing,那是不是可以用anti-Pol II(S5-p那一支抗體)做ChIP再以gene-specific primer做PCR來分析?我覺得以”rapid induction upon stimulation”或”expression at later stage”而言,許多viral gene都符合。論文題材唷,好好思考一下。