LabMeeting-Ingrid
由 EVKVLIN 在 三, 02/12/2014 – 00:00 發表 LIN Lab 2016 Ingrid LabMeeting YCK
2008/09/23 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: (1) 366/367EE抑制現象,366/367AA活化現象無法重現.TK-RL,TK-hRL均出現不同實驗組不同數值之現象. (2) GST-Q658 is ready for affinity purification. 因lysozyme可有效打破細菌,所以freeze-thaw步驟可免. (3)NP460TetER, NP460TetKR部份請停下,毋須再suffer了,可能的話把精力挪到小嬿的clone上,她第一次screen,難免會手忙腳亂.
2008/10/07 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:DLR western blot analysis沒有測出Flag-bands; pFA-GAL4系列質體活性測試(1:5+EF1-RL為internal ctrl)實驗已完成,等OrionL發完脾氣後才可得到實驗結果;著手進行7個T366及T367(含WT)全長的expression與DLR assay.
2008/10/14 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: DLR 大部份okay,少數transfection到最後幾個sample都有數值劇降情形.建議找出可以”under control” 的盤數(是不是做到後來沒力了?).把有問題的再補做一次(那趨勢到底是怎麼樣呢?) Expression level實驗除T366A外幾乎完美,請繼續修補(ps1 slide上label這樣的T366A是看不到的,這樣的T366A才 清楚。隨時要體貼聽眾的眼耳鼻舌身意,利他做得多,是可以增長福報的; ps2注意我們paper上的圖每個mutant只秀一個clone即可)。KR的好抗體所剩不多,我們要加快做抗體的腳步,所以請幫忙找(A)有沒有 purify protein的地方?(B)如果給GST-clone,到做出rabbit polyclonal大致經費是多少?Thanks.
2008/10/21 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: Antibody部份改以peptide當antigen.請幫忙尋價。謝謝。《結論:億康及亞諾法並行》。
2008/11/04 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:Unable to purify enough GST-Q658 for antibody production,決定以合成peptide方式作為抗原來源。另外,能否請ingrid把白板上AB730的實驗步驟做記錄呢?是的,你的notebook寫得很好☺。
2008/11/18 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:Thaw TW01Tet、HONE1Tet,準備塞入ER, gZ。DLR結果持續整理中(喜歡老闆加DNA及vortex的方法,哈哈哈哈哈…)
2008/11/25 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: Performed 293/rKSHV latency disruption assays. OGlcNAc mutants showed increased activity in PANp-deRed.
2008/12/10 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: (1)293/rKSHV 及 293TetR/rKSHV latency disruption assays 都顯示OGlcNAc mutant活性較wild type稍高(good! congratulations!)。 (2)不小心污染293FT, 重新製備ER與KR的lentivirions,預計下週感染HONE1TetR及 TW01TetR。 (3)委外的KRTA抗體製備順利進行中。(4)請協助小嬿的HONE1TetgZ and TW01GetgZ(我今年年初titrate HONE1及TW01的killing濃度是50~100ug就夠了耶).
2008/12/16 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:篩選TW01TetKR, TW01TetER,HONE1TetKR and HONE1TetER中。加訂KRS634, 636 phospho-antibody.
Ingrid:篩選TW01TetKR, TW01TetER,HONE1TetKR and HONE1TetER中。加訂KRS634, 636 phospho-antibody.
2008/12/23 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:第二次的KSHV latency disruption assay仍然看到O-GlcNAC對KRTA似乎是抑制作用!進行western-flag檢測transfection及下游基因表現情形。
Ingrid:第二次的KSHV latency disruption assay仍然看到O-GlcNAC對KRTA似乎是抑制作用!進行western-flag檢測transfection及下游基因表現情形。
2009/01/06 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:以western測試KR+KROGlcNAc mutant disrupt latency之效果。
2009/01/20 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid：OGlcNAc對KR在PANp活性上具抑制作用(flow及DLR),可是對KbZIP卻又有正調控作用,why?
2009/02/10 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:(1) 確定T366/T367 DLR之圖中…(2)確定T366/T367 Flow之圖中…(3)確定T366/T367 transient expression之western圖中…(4)準備重做HONE1TetER, TW01TetER, HONE1TetKR, and TW01TetKR。
2009/02/24 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:整理OGlcNAc366/367T→A之結果。
2009/03/10 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:Finalize T366/T367部份結果。
2009/03/24 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:TW01TetER 繼續篩選中,強力禱告中…Screen時先點兩個slide,以IFA來看Rta表現情形,就是類似心瀅、小嬿做的那樣子。如果percentage太 低,我們就不要那個clone。所以western是在IFA後再做即可。另外請不要再tryTW01KR部份了(NPC cell並非KV的default host)。要的話時間拿來做HoneTetER. 謝謝。
2009/03/31 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:九株 TWo1TetER以IFA(1:500)檢查 induction情形,二個好clone,三株空包彈,其餘induction rate不及50%, 後續將confirm size及growth arrest能力。小結:ingrid你果然對stable clone的養成殺很大!謝謝你!(如果7號和11號的size對,p21也有出來,我們就來請小嬿把EV及KV分別送入,一個月後就有名叫 TW01EREV及TW01ERKV的寶寶出生了耶)
2009/04/07 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:Screening of TW01TetER (n=21),手氣極順,希望ER還是完整、有功能的。續以western及growth rate確定之。
2009/04/21 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: Characterization of TW01TetER. Looks good, 下一步來送紅綠病毒進去怎麼樣?
2009/05/05 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: Screening of HONE1TetER (#8, #5).
2009/05/26 Lab Meeting 心得彙整 (單醣乙醯化與KR更新)
Suggestions from the audience and experiemnts in progress:
A】加做M2Flag IP-OGlcNAc Western, reveal the O-GlcNAcylation status of KR and O-GlcNAc mutants in 293 cells. B】加做M2Flag IP-4A4 Western, reveal the O-phosphorylation status of KR and O-GlcNAc mutants in 293 cells. C】Overall O-GlcNAcylation profiles in ERKV and TRex-BCBL1-KRTA. D】繼續以flow cytometry analyze KR 及O-GlcNAc mutant disrupt 293/KSHV之能力 .
重要:因為所須protein量多,所以scale宜大(至少半盤6-well palte).另外要記得放NCOAT inhibitor(GlcNAc)在lysis buffer中.
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1/12/2009 論文大綱:
A】 在293TetKR中所表現的蛋白質分子量與預期值(691*110=76kDa)及IVT做出的蛋白質 (98kDa)差異相當大,猜測K-RTA接受宿主細胞相當程度的PTM修飾作用。為瞭解O-GlcNAcylation是否參與其中,便以anti- OGlcNAc抗體檢測affinity-purified的KR,NLSm,ER,RR。
B】LC-ms/ms訂出K-RTA的O-GlcNAcylation的可能位點是T366和T367。
C】以三種功能測試系統(➀luciferase-PANp➁luciferase-TA➂latentcy disruption)來測試T→A及T→E的各突變株和野生種之差異,結果顯示O-GlcNAcylation對K-RTA的修飾應是具負調控的影響。
D】 BCBL1TetKR及ERKV中cellular Sp1和K-RTA被O-GlcNAcylation的kinetics相仿→均是先低後高,暗示著➀宿主細胞可能透過O-GlcNA來負調節所 modify蛋白質的活性➁被O-GlcNAcylation的蛋白質較穩定,不會被病毒reactivation時產生的proteasome系統分解 掉。
E】類似範例(待續…)
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10/23/2008
DLR 實驗可以finish-up了、六孔盤expression level也可以收尾,剩下disruption實驗請協助WHT尋找最佳target cell。Antibody製備改以peptide為antigen source,請幫忙尋價。NAS上有一份蛋白質序列請先下載,提醒我給你那兩段好的抗原序列。Thanks.
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10/3/2008 SFL wrote: 這是專給YCK的:題目訂為
Suppression of the Transactivation Activity of Replication and Transcription Activator of Kaposi’s Sarcoma Associated Herpesvirus with O-GlcNAcylation
在NAS上有新的圖檔,花了許多功夫把七月底的56MB檔案瘦身為39MB.但還是好大,我把它拆成二個檔,part1&2.請下載並幫忙補入新結果(圖檔請掃300 dpi即可)(餘待續)
2009/06/10 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: OGlcNAc paper加作之實驗規劃與進度報告(notes: co-IP部份做HDAC1即可(lab已有antibody),recover BCBL1TRex-KR是為了看global O-GlcNAcylation變化)
2009/07/08 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: Global O-GlcNAcylation status in ERKV and BCBLTetKR.
2009/07/15 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: Kinetics of global O-GlcNAcylation status in ERKV and BCBLTetKR(苦痛即將離,請務必熬出頭~).
2009/08/11 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: Global O-GlcNAcylation seemed to be dropped at the end of dox treated ERKV and BCBL1.（不好意思, 最近都沒時間關照你,下週應會有機會囉~)
2009/08/25 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: First trial of virus yield in 293Tet/KSHV ectopically expressed wild type, T366A, T367A, 366dm, and 366EE.
2009/09/01 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: Design experiments to help yang in selecting good expressions of FLAG-ER in TW01Tet cell lines.
2009/09/08 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: Thaw 6 TW01TetER subclones for future studies.
2009/12/22 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: 報Paper這裡. 口水裡的寶物/髒東西還真不少啊. Good presentation! Thank you~
2010/01/05 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: 著手製備HeLaTetgZ/cZ/GFP, HONE1TetER/GFP, TW03Tet, CGHNK2Tet之偉大工程.這次包病毒可否考慮使用instructional manual中述及的方式,可提高3~4倍病毒量.
2010/02/02 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: 走在最前→製備各種有用細胞株! 辛苦你了♡∞
2010/03/02 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: HeLaTetGFP已挑到3株clone#3 #4 #5，且pool在一起並凍起來。
2010/03/16 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: HeLaTetgZ已挑到clone,且正在以western blot analysis及 IFA characterize中。HONE1Tet部份則仍未挑到clone,努力中。加油 and 辛苦了!
2010/04/06 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: HONE1TetGFP及ER均挑不到滿意的clone. 懷疑HONE1Tet本身並未大多數具有TetR.
2010/04/20 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: Validate the HeLaTetgZ clones by western blot analysis。
2010/05/25 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: 報paper:NP460hTert/EBV。謝謝。
2010/05/26 Lab Meeting 心得彙整 (未來目標)
Ingrid: Characterize TW01TetER #7 and #19, including (1) growth curve,doubling time, wst-1 (2) expression kinetics of cell cycle regulators between Dox 3h-Dox 72h. (3) OGT-1/NCOAT shRNA對KSHV reactivation之影響 (以HMEC-1/rKSHV來做)
Ingrid: Characterize TW01TetER #7 and #19, including (1) growth curve,doubling time, wst-1 (2) expression kinetics of cell cycle regulators between Dox 3h-Dox 72h. (3) OGT-1/NCOAT shRNA對KSHV reactivation之影響 (以HMEC-1/rKSHV來做)
2010/06/29 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:及時影像攝影第一話 Dox treated ERKV cells (93-119 h). Burst,busrt,bang,bang,bang! 太酷了.
2010/07/13 LabMeeting 心得彙整
Ingrid : Characterization of TW01TetER #7 and #19, part I: expression kinetics of Rta, MYC, CDK6, p53, p21, p27 and SFN by western blot analysis.
2010/07/27 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid:及時影像攝影第二話: Dox treated ERKV cells (Dox 49-74, Dox75-99, Dox93-119)。
2010/09/29 ( 報告去英國參加EBV研討會的感想)
針對我的POSTER
Dr. Tsao提出以下的問題
1. TW01TetEREVp2089是否產生具有感染性病毒顆粒?(目前無)
2. 有考慮送入Zta做stable clone嗎?(Rta在epithelial cell內比Zta更能夠活化EBV溶裂期)
3. senescence與lytic cycle的關連?
(以下簡述SEL在噗浪的發言 謝謝SFL:)
Senescence大致分兩類,一種是replicative senescence就是telomere越來越短的”自然老化”; 另一類是oncogene-induced的senescence簡稱OIS.我們Rta造成的senescence屬第二型.)
Dr. Tsao提出以下的問題
1. TW01TetEREVp2089是否產生具有感染性病毒顆粒?(目前無)
2. 有考慮送入Zta做stable clone嗎?(Rta在epithelial cell內比Zta更能夠活化EBV溶裂期)
3. senescence與lytic cycle的關連?
(以下簡述SEL在噗浪的發言 謝謝SFL:)
Senescence大致分兩類,一種是replicative senescence就是telomere越來越短的”自然老化”; 另一類是oncogene-induced的senescence簡稱OIS.我們Rta造成的senescence屬第二型.)
另外報告
1. Dr. Shannon C. Kenny的海報中，提出Na在上皮細胞中會與p53一同誘導lytic protein表現
2. Dr. Tsao的海報中，他們建立了HONE1-EBV、HK1-EBV及NP460htert-EBV細胞株，其中前二者可以產出有感染力的病毒顆粒。送入 EBV的方式則是用Akata 細胞株進行cell-to-cell contact方式進行，成功送入EBV的細胞會發綠光，再以TPA加以誘導使其進入lytic cycle以產生病毒。還有說明加入TPA，雖然細胞的綠光會變強，但並不表示一定會產生相對應多的病毒。
1. Dr. Shannon C. Kenny的海報中，提出Na在上皮細胞中會與p53一同誘導lytic protein表現
2. Dr. Tsao的海報中，他們建立了HONE1-EBV、HK1-EBV及NP460htert-EBV細胞株，其中前二者可以產出有感染力的病毒顆粒。送入 EBV的方式則是用Akata 細胞株進行cell-to-cell contact方式進行，成功送入EBV的細胞會發綠光，再以TPA加以誘導使其進入lytic cycle以產生病毒。還有說明加入TPA，雖然細胞的綠光會變強，但並不表示一定會產生相對應多的病毒。
2010/11/10
1. 想要測試Dox對TW01Tet的生長是否有所影響，結果失敗。下次要收短時間測試(如1、2、3天)。
2. 篩選TW03Tet及TW05Tet細胞株。TW03Tet：24株裡有19株長起來；TW05Tet：24株裡有12株長起來。目前皆放在6 well內等待Western blot測試TetR。
3. OGT抗體無法辨認抗原，已重新購買。另外要解決internal control在每個sample中的量皆不相同的問題。
4. 將shMGEA5送入ERKV細胞中，”似乎”可以使發紅光的細胞比例上升，要再進一步詳細確認。
2. 篩選TW03Tet及TW05Tet細胞株。TW03Tet：24株裡有19株長起來；TW05Tet：24株裡有12株長起來。目前皆放在6 well內等待Western blot測試TetR。
3. OGT抗體無法辨認抗原，已重新購買。另外要解決internal control在每個sample中的量皆不相同的問題。
4. 將shMGEA5送入ERKV細胞中，”似乎”可以使發紅光的細胞比例上升，要再進一步詳細確認。
2010/12/07 Lab Meeting 心得彙整
Ingrid: (1) 持續screen TW03Tet and TW05Tet。 (2) OGT antibody 測試中。
2010/12/22
報告Hart新作：
(1) 以chemoenzymatic assay及抗體確認histone有O-GlcNAcylation
(2) 以LC MS/MS定義出histone上有被O-GlcNAc修飾的位點：Ser47 of H4、Ser36 of H2B和Thr101 of H2A
(3) Heat shock(45℃，1hr)及後續的recovery的時候，發現histone的O-GlcNAc程度逐漸提升，同時OGT活性也有緩慢上升
(4) 以MNase chromatin-sensitivity assays檢測發現Heat shock及後續的recovery時候，Chromatin(染色質)會condense
(5) 過量表現OGT會比過量表現GFP的細胞的染色質更加condense
(1) 以chemoenzymatic assay及抗體確認histone有O-GlcNAcylation
(2) 以LC MS/MS定義出histone上有被O-GlcNAc修飾的位點：Ser47 of H4、Ser36 of H2B和Thr101 of H2A
(3) Heat shock(45℃，1hr)及後續的recovery的時候，發現histone的O-GlcNAc程度逐漸提升，同時OGT活性也有緩慢上升
(4) 以MNase chromatin-sensitivity assays檢測發現Heat shock及後續的recovery時候，Chromatin(染色質)會condense
(5) 過量表現OGT會比過量表現GFP的細胞的染色質更加condense
2010/12/29
報告進度
(1) TW03Tet有10株細胞株，TW05Tet有8株細胞株，已凍管且收好cell lysates等待Western analysis確認。
(2) 目前要進行的實驗如下
a. 將不同稀釋倍數(0、1、1/2、1/4、1/8、1/16)的pAS-EGFP lentivirus送入293中，48小時後，計數細胞存活及死亡比率，同時跑FLOW。(這次infection時，不從細胞上移除含有polybrene的medium)
b. 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus送入ERKV中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質是否有減少。
c. 將OGT Ab的條件抓好。
(1) TW03Tet有10株細胞株，TW05Tet有8株細胞株，已凍管且收好cell lysates等待Western analysis確認。
(2) 目前要進行的實驗如下
a. 將不同稀釋倍數(0、1、1/2、1/4、1/8、1/16)的pAS-EGFP lentivirus送入293中，48小時後，計數細胞存活及死亡比率，同時跑FLOW。(這次infection時，不從細胞上移除含有polybrene的medium)
b. 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus送入ERKV中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質是否有減少。
c. 將OGT Ab的條件抓好。
2011/01/26
報告進度
(1) TW03Tet：因挑選細胞株TetR表現差，故重新挑選。
TW05Tet：以#4進行接下來的穩定細胞株篩選 (#3、#4及#6送入液態氮)，包括Flag-Luc、Flag-gZ+Rta(1：3)、Flag-Rta
(2)以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4×10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質是否有減少。
(3)以SK-N-SH cell lysates當作OGT Ab的positive control，同時確認goat二抗是否可用。
(1) TW03Tet：因挑選細胞株TetR表現差，故重新挑選。
TW05Tet：以#4進行接下來的穩定細胞株篩選 (#3、#4及#6送入液態氮)，包括Flag-Luc、Flag-gZ+Rta(1：3)、Flag-Rta
(2)以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4×10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質是否有減少。
(3)以SK-N-SH cell lysates當作OGT Ab的positive control，同時確認goat二抗是否可用。
2011/02/23
報告進度
(1) TW05TetER：#1-18中，除了#1及#12以外，其餘在IFA中，為FLAG Ab陽性，重複做IFA(點片)以重複確認。
(2) 以SK-N-SH cell lysates做OGT Ab的western analysis，覺得沒有認到目標蛋白質，再以Hela cell lysates當positive control及黃老師家的goat二抗再確認。
(1) TW05TetER：#1-18中，除了#1及#12以外，其餘在IFA中，為FLAG Ab陽性，重複做IFA(點片)以重複確認。
(2) 以SK-N-SH cell lysates做OGT Ab的western analysis，覺得沒有認到目標蛋白質，再以Hela cell lysates當positive control及黃老師家的goat二抗再確認。
2011/03/16
(1) Dox誘導型細胞株的選殖
TW05TetLuc：#1-6測試中
TW05TetER：#2-18的WB有認到ER，重新做IFA以確認表現蛋白質的比例及強弱
TW05TetER/gZ：#1-33測試中
(2) 以SK-N-SH cell、HelaTet、TW03Tet及TW05Tet lysates做OGT Ab的western analysis，用黃老師家的goat二抗，沒有認到目標蛋白質，重買OGT Ab。
(3) 以shLuc、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4×10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質的確有減少，B2效果比D2好。
TW05TetLuc：#1-6測試中
TW05TetER：#2-18的WB有認到ER，重新做IFA以確認表現蛋白質的比例及強弱
TW05TetER/gZ：#1-33測試中
(2) 以SK-N-SH cell、HelaTet、TW03Tet及TW05Tet lysates做OGT Ab的western analysis，用黃老師家的goat二抗，沒有認到目標蛋白質，重買OGT Ab。
(3) 以shLuc、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4×10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質的確有減少，B2效果比D2好。
2011/03/30
(1) 以shLuc、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4×10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質的確有減少，B2效果比D2好。shLuc的lysates中，MGEA5的表現隨 著時間增加而增加(?)。
(2) 以shLuc、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4×10^5/ml/well/12well) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，MGEA5減少最多的B2，所引發的lytic reactivation越強烈。加入Dox也會引起MGEA5表現增加(?)。總之，將D2提高至1/4，再加入2個NC(有shRNA但未加 Dox)，重做一次。
2011/04/27
(1) 以shLuc、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4×10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質的確有減少，A1效果比D1好。shLuc的lysates中，OGT的表現隨著時 間增加而增加(?)(但Tubulin也隨之增加?)。
(2) 以shLuc、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4×10^5/ml/well/12well) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，因結果難以得出結論，故重新hybridize with OGT Ab。
(3) 以shLuc、shMGEA5、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4×10^5/ml/well/12well) 中，24小時後加Dox，再72小時收lysates進行WB確認，似乎引起的lytic reactivation沒有差異或看不出關聯性(與之前做的結果不一樣)。
2011/05/25
(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6×10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，發現shOGT-A1及shMGEA5-B2皆比shLuc引起更多的lytic reactivation。且送入shOGT的細胞樣本中，除了OGT蛋白質減少，MGEA5蛋白質也減少，送入shMGEA5的細胞樣本中，除了 MGEA5蛋白質減少，OGT蛋白質也減少。重複之前收集的2次實驗樣本，也得到一樣的結果。進行Q-PCR檢查送入shOGT的細胞樣本中，MGEA5 的mRNA是否有減少，避免shRNA有認錯目標的效用。且用IP將KR抓下，用WB來確認O-GlcNAc變化程度。
(2) 將TW05TetER的＃7+9+10+12 (Flag Positive ratio=87~-96％) pool成一個clone。
(3) 重新建立TW01TetLuc及TW05TetLuc，目前正在用Zeocin篩選clones。
(4) TW05TetER/gZ有28clones進行WB篩選，Rta alone、gZ alone和Rta+gZ皆有篩出，接下來進行IFA確認。
(2) 將TW05TetER的＃7+9+10+12 (Flag Positive ratio=87~-96％) pool成一個clone。
(3) 重新建立TW01TetLuc及TW05TetLuc，目前正在用Zeocin篩選clones。
(4) TW05TetER/gZ有28clones進行WB篩選，Rta alone、gZ alone和Rta+gZ皆有篩出，接下來進行IFA確認。
2011/06/22
(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6×10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收細胞計數螢光比例(第4次實驗)。發現綠螢光的細胞佔全部細胞約80-85%；紅螢光的細胞佔綠螢光細胞約30% (Dox)、5-10%(NC)、30%(shLuc)、40-50%(shOGT-A1)及65-70%(shMGEA5-B2)。收lysates進 行WB確認。且用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度。
(2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。由於結果無法排除off-target作用，進行或重複實驗以確認。
(3) TW01TetLuc有2株clones及TW05TetLuc有8株clones進行IFA (Flag Ab) 確認。由於背景值太高，無法確定是否有Luc蛋白質表現，故進行WB以確認。
(2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。由於結果無法排除off-target作用，進行或重複實驗以確認。
(3) TW01TetLuc有2株clones及TW05TetLuc有8株clones進行IFA (Flag Ab) 確認。由於背景值太高，無法確定是否有Luc蛋白質表現，故進行WB以確認。
2011/07/13
(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；結果是可以成功以KR(660) from ICON將KR抓下，但是效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。接下來會以重收細胞(以EBC Buffer溶解細胞)、增加cell lysate或KR(660)的量來改進IP效率。NOTE：以6% SDS-PAGE分析；KR(Ueda)會認到2條band?
(2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。結果發現ACTIN primer會影響，但GAPDH不會影響。經重複實驗，排除off-target作用。
(3) TW01TetLuc有4株clones及TW05TetLuc有4株clones進行WB (Flag Ab) 確認為positive。接著進行計數細胞，將生長速率差不多的細胞混合。NOTE：Flag Ab是否有問題?
(2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。結果發現ACTIN primer會影響，但GAPDH不會影響。經重複實驗，排除off-target作用。
(3) TW01TetLuc有4株clones及TW05TetLuc有4株clones進行WB (Flag Ab) 確認為positive。接著進行計數細胞，將生長速率差不多的細胞混合。NOTE：Flag Ab是否有問題?
2011/08/24
(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；經更改IP流程，可以有效率以KR(660) from ICON將KR抓下(ERKV_Dox48h)，但是之後應用於ERKV_shLuc_Dox48h、ERKV_shOGTA1_Dox48h及 ERKV_shMGEA5B2_Dox48h，卻效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。目前持續改進IP流程中。Note:如果是要看 KR蛋白質，建議Lysis buffer要加phosphotase inhibitor以避免KR的碎裂。
(2) 關於進行shRNA的Q-PCR，已完成實驗數據。但是分析時，應注意星號的標誌，正確為*p<0 .05="" p="" span="">
(3) 經由計算細胞生長速率及考慮表現Luc蛋白質的程度，混合細胞得到TW01TetLuc pool :#2+ #8及TW05TetLuc pool:#1+ #3+ #5。
(4) 三種Flag Ab測試(Sigma F1804舊、Cell Signaling及Sigma F1804新)：認識Luc蛋白質在TW01TetLuc pool及TW05TetLuc pool的titer皆差不多，除了Cell Signaling背景比較髒。
2011/09/21
報告Thorley-Lawson DA.在上個月的PLoS Pathogens發表的paper
A Novel Persistence Associated EBV miRNA Expression Profile Is Disrupted in Neoplasia. 作者利用primary normal infectious tissues : LCL, NCB, MemB及tumor biopsies : HD, NPC, GaCa, BL進行34種EBV miRNA分析。將12種BART miRNAs命名為latency III associated miRNAs。而這些miRNA在分類為latency I (BL) 及latency II (HD, NPC, GaCa) 腫瘤組織中皆失去控制而表現量增加；相對於另一群EBV miRNAs，則BHRF1 miRNAs (大部分皆表現在latency III的LCL) 則並未失去控制而表現量很低。接著以heat-map/clustering或principal component analysis進行資料分析，發現並沒有tumor-specific miRNA，但综合所有數據，的確可以將不同腫瘤分類，類似於電腦界及物理界的”secret sharing”定律，舉例說明，在約40種miRNAs中，任選5個miRNA就足以將腫瘤分類成功的機率約為60%。最後以細胞株進行分析，發現若以 研究miRNA而言，這些腫瘤細胞的表現形式已與他們的來源腫瘤組織不同。
A Novel Persistence Associated EBV miRNA Expression Profile Is Disrupted in Neoplasia. 作者利用primary normal infectious tissues : LCL, NCB, MemB及tumor biopsies : HD, NPC, GaCa, BL進行34種EBV miRNA分析。將12種BART miRNAs命名為latency III associated miRNAs。而這些miRNA在分類為latency I (BL) 及latency II (HD, NPC, GaCa) 腫瘤組織中皆失去控制而表現量增加；相對於另一群EBV miRNAs，則BHRF1 miRNAs (大部分皆表現在latency III的LCL) 則並未失去控制而表現量很低。接著以heat-map/clustering或principal component analysis進行資料分析，發現並沒有tumor-specific miRNA，但综合所有數據，的確可以將不同腫瘤分類，類似於電腦界及物理界的”secret sharing”定律，舉例說明，在約40種miRNAs中，任選5個miRNA就足以將腫瘤分類成功的機率約為60%。最後以細胞株進行分析，發現若以 研究miRNA而言，這些腫瘤細胞的表現形式已與他們的來源腫瘤組織不同。
2011/11/09
1. 在ERKV細胞中，將shLUC、shOGT及shMGEA5 lentivirus分別送入，再經由Dox treatment使KSHV進入lytic reactivation，收集medium並用Q-PCR測量產生的KSHV copy number，結果依序為shLUC＜shOGT＜shMGEA5。
2. 製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGExHis_KR_Q658stop and pGExHis_cZ :KRQ658表現蛋白量很少，以至於無法正確判斷是哪一條band，故重新表現蛋白質並以His Ab確認，同時確認質體是否錯誤(原template: GEx-2T-GST_KRQ658)；Zta蛋白質表現量極佳，已送出代製抗體。PS理論上，Zta為270aa約為30kDa，但在SDS-PAGE gel上的band為38kDa，多出8kDa?
(2) pGExHis_ER_Q320stop and pGExHis_ER_L550stop
(3) pGExHis_KR_E600stop and pGExHis_BALF3
(1) pGExHis_KR_Q658stop and pGExHis_cZ :KRQ658表現蛋白量很少，以至於無法正確判斷是哪一條band，故重新表現蛋白質並以His Ab確認，同時確認質體是否錯誤(原template: GEx-2T-GST_KRQ658)；Zta蛋白質表現量極佳，已送出代製抗體。PS理論上，Zta為270aa約為30kDa，但在SDS-PAGE gel上的band為38kDa，多出8kDa?
(2) pGExHis_ER_Q320stop and pGExHis_ER_L550stop
(3) pGExHis_KR_E600stop and pGExHis_BALF3
2012/01/05
製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體 (全部已clone成功)
(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop
(4) pGEXHis_BALF3
(2)(3)(4)除pGEXHis_ER_L550stop尚未表現，其餘在BL21表達蛋白質皆不明顯增多，且皆比預測值大約6-8kDa。
目前採取的策略如下
(1) 使用未開封的LB/BHI或跟其他實驗室要一點LB來做control
(2) 表現蛋白質時，Amp濃度提高至200ug/ml，IPTG濃度降至0.1或0.5mM，加IPTG前應養約3-5小時直到OD600=0.6，同時使用DH5α作表現。
(3) 做BL21及DH5α的competent cell
林 同學的論文中提及她用的ER1-320中(Dr. Miller提供，疑是B95-8 strain)很多Arg皆已被突變掉，包括Arg83、86、88、89及90，在我們MABA strain，這些位置皆是Arg。另外根據PWW的紀錄，二者的核酸序列有10個不同處，但只有2個amino acid不同。
(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop
(4) pGEXHis_BALF3
(2)(3)(4)除pGEXHis_ER_L550stop尚未表現，其餘在BL21表達蛋白質皆不明顯增多，且皆比預測值大約6-8kDa。
目前採取的策略如下
(1) 使用未開封的LB/BHI或跟其他實驗室要一點LB來做control
(2) 表現蛋白質時，Amp濃度提高至200ug/ml，IPTG濃度降至0.1或0.5mM，加IPTG前應養約3-5小時直到OD600=0.6，同時使用DH5α作表現。
(3) 做BL21及DH5α的competent cell
林 同學的論文中提及她用的ER1-320中(Dr. Miller提供，疑是B95-8 strain)很多Arg皆已被突變掉，包括Arg83、86、88、89及90，在我們MABA strain，這些位置皆是Arg。另外根據PWW的紀錄，二者的核酸序列有10個不同處，但只有2個amino acid不同。
2012/02/29
製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop
(4) pGEXHis_BALF3
(1)的代製抗體已收集，經由細胞lysate測試，證實可以辨認EBV Zta，但akata strain的Zta 的mobility(略低)與細菌表現的不同，接下來要釐清抗體是否有純化，且可否應用於IFA或IP。 (也要釐清是否會辨認B95.8 strain的Zta)
(2)(3)(4)在BL21、DH5α及Rosetta-gami2中，經過調整表達條件，目標蛋白質皆不明顯增多。
(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop
(4) pGEXHis_BALF3
(1)的代製抗體已收集，經由細胞lysate測試，證實可以辨認EBV Zta，但akata strain的Zta 的mobility(略低)與細菌表現的不同，接下來要釐清抗體是否有純化，且可否應用於IFA或IP。 (也要釐清是否會辨認B95.8 strain的Zta)
(2)(3)(4)在BL21、DH5α及Rosetta-gami2中，經過調整表達條件，目標蛋白質皆不明顯增多。
2012/03/26 (未來的實驗計畫)
1. EBV RTA Ab
(1)我自己做會再試試Rosetta-gami2，不然就要換其他plasmid—我看我老公論文換plasmid後，表現量有差 (同時濁水溪丁先生也是這樣建議)。
(2)濁水溪丁先生來看過WB結果，說把ERQ320 plasmid拿回去純化試試看 (若不成功不用錢)，已經將plasmid給他，約估花2-3禮拜。
(3)基龍米克斯也有蛋白質純化的服務，他們公司的post-doc可以幫忙試不同plasmid X 不同compentent=一個條件8000元，不成功(蛋白質產量未達到0.5mg/L)的話要2500元(試劑費)。
(1)我自己做會再試試Rosetta-gami2，不然就要換其他plasmid—我看我老公論文換plasmid後，表現量有差 (同時濁水溪丁先生也是這樣建議)。
(2)濁水溪丁先生來看過WB結果，說把ERQ320 plasmid拿回去純化試試看 (若不成功不用錢)，已經將plasmid給他，約估花2-3禮拜。
(3)基龍米克斯也有蛋白質純化的服務，他們公司的post-doc可以幫忙試不同plasmid X 不同compentent=一個條件8000元，不成功(蛋白質產量未達到0.5mg/L)的話要2500元(試劑費)。
2.Zta Ab抗體純化
(1)proteinA/G純化—丁先生說通常是延長抗體保存期限，我們保存在-80度應該OK，不過丁先生也不敢一定保證。
(2)antigen column—可提高專一性，但若用(1)純化可得約10-20mg/20ml serum，但用(2)可得2mg/20 ml serum (應該還是會有些抗體掉了)
(1)proteinA/G純化—丁先生說通常是延長抗體保存期限，我們保存在-80度應該OK，不過丁先生也不敢一定保證。
(2)antigen column—可提高專一性，但若用(1)純化可得約10-20mg/20ml serum，但用(2)可得2mg/20 ml serum (應該還是會有些抗體掉了)
問過萍學姊，他建議我用NA/TS在做一次，因為他用的是EREV/Dox，本來就會大量表現ZTA，看是不是也是1:5000的稀釋條件是OK的。
PS 萍學姊說他們實驗室都沒有純化抗體，只有應reviewer的建議純化少許抗體作實驗。
3.NP460htert (是不是要先等FY決定題目)
現在實驗室剩
(1)DKSFM+Epi:在去年年底混和好，目前剩有回溫過的150ml+在冷房的200ml (7266元/1L，約等貨14-20天)
(2)KGM-2在20111025購買500ml全新未拆封—冰箱有20ml之前留下來的 (10000元/1L)
現在實驗室剩
(1)DKSFM+Epi:在去年年底混和好，目前剩有回溫過的150ml+在冷房的200ml (7266元/1L，約等貨14-20天)
(2)KGM-2在20111025購買500ml全新未拆封—冰箱有20ml之前留下來的 (10000元/1L)
PS
(1)有看過宜津的DATA是建議2ng/ml TGF-B作實驗=Dr.曹做NP460_EBVakata的條件
(2)小夏當初TW05EREV—PEG濃縮病毒可以明顯提高感染率，但TGF-B只有一咪咪
(1)有看過宜津的DATA是建議2ng/ml TGF-B作實驗=Dr.曹做NP460_EBVakata的條件
(2)小夏當初TW05EREV—PEG濃縮病毒可以明顯提高感染率，但TGF-B只有一咪咪
2012/05/02
1.製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGEXHis_cZ :已分裝保存於-80℃冰箱。可用於WB(1:2000)(萍)、IFA(1:2000)(鏸)及免疫組織染色 (1:1000)(鏸)。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop : Q320stop已送給濁水溪代製。另外構築pGEXHis_ER_277E-516V做蛋白質表達。
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop :蛋白質表現量太少(失敗)。
(4) pGEXHis_BALF3 :蛋白質表現量太少(失敗)。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop : Q320stop已送給濁水溪代製。另外構築pGEXHis_ER_277E-516V做蛋白質表達。
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop :蛋白質表現量太少(失敗)。
(4) pGEXHis_BALF3 :蛋白質表現量太少(失敗)。
2.使用EGFP當目標基因來測試建立NP460TetR_ER inducible cell lines的條件：用未稀釋的lentivirus病毒液直接感染6小時後移除，細胞發綠光比例接近100%，之後細胞放大後，使用10 ug/ml zeocin作篩選16天，發現未加Dox與有加Dox的綠光比例類似，建議做WB(flag)作確認。
3.萍使用Mini-PROTEAN II multiscreen apparatus (Bio-rad)來進行抗體最佳稀釋倍數的實驗。相關資料在https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP /f9ec3085-b590-44c6-9b36-b36876cad466/Mini-PROTEAN_II_Multiscreen_Apparatus
首先置備只有一個well的膠體，樣品量為單一well*20=200ug (萍通常使用量)，轉漬完的NC膜置於裝置內，略將裝置傾斜後，從下面的孔注入600ul抗體稀釋液(避免氣泡)，室溫靜置2小時後，以Tip移除抗體稀 釋液，用TBST清洗3次後，將裝置打開把NC膜拿出，進行後續二抗的雜交實驗。
2012/08/15
分析akata EGFP-EBV感染NP460hTert之後會發生什麼事 :
- 調整很多條件使感染率提高。
- Rta及下游基因，以及Zta RNA皆在病毒感染後的細胞有偵測到。
- 但是用WB及IFA仍無法偵測到病毒蛋白質的表現，目前仍在確認中。
2013/02/27
- 比較Imatinib、Dasatinib及Nilotinib對於OSCC cells生長的影響。
- 進行PD173074(FGFR inhibitor)對於OSCC cells生長的影響。發現具有fusion gene的C9細胞的確有受到抑制生長。
- 分享關於DNA定序的演進。
2013/08/28
(一) Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 2013 Mar;35(3):454-63. 主要是利用NGS技術分析頭頸部癌症臨床檢體，發現突變頻率比較高的基因依序為TP53、NOTCH1、HRAS、PIK3CA、CDKN2A。
(二) HPV與頭頸部癌症的關聯
- HPV陽性感染的頭頸部癌症病人預後比較好。
- HPV陽性感染的頭頸部癌症病人的基因突變率比陰性的還要少。
- HPV陽性感染的頭頸部癌症的腫瘤基因表現比較近似其他種.HPV陽性感染癌症，HPV陰性感染的頭頸部癌症的腫瘤基因表現比較近似肺部鱗狀上皮細胞癌。
- 頭頸部癌症有多種病毒感染，主要是HPV-16，其他包括HPV(18、92、10、26、53、32、6b)、Herpes virus(HSV-1)、HepB virus與polyoma virus。
2014/02/12報告Bill Sugden的論文: Epstein-Barr Viral Productive Amplification Reprograms Nuclear Architecture, DNA Replication, and Histone Deposition. Cell Host Microbe. 2013 Dec 11;14(6):607-18.
| Date | Title |
| 05/06/12 | Ingrid: NP460TetR_EGFP未加Dox的EGFP蛋白質表現量仍然偏高，故本計劃暫時中止。 |
| 05/06/12 | Ingrid: 建構pGEXHis_ER277-516，目前TOPO TA cloning (pCR2.1) 已經成功, PCR及RE check皆OK，現在正在送定序。 |
| 05/30/12 | Ingrid: 已成功建構pGEX6His_ER277-516，PCR check已OK，接下來想要送入BL21，以便之後做蛋白質表達用。 |
| 06/06/12 | Ingrid: 將pGEXHis_ER277-516送入BL21表現，SDS PAGE結果在27kDa有疑似induced band，WB結果為His Ab認識的主要的band在43kDa。 |
| 06/06/12 | Ingrid: 目前正以以Rta Ab(Argene)確認其正確位置。 |
| 06/27/12 | Ingrid:更改很多條件後(提高細胞滿度、純化病毒時要混合過夜、更改TGFb濃度、medium加FBS等)，可以將感染率最高提升到60% |
| 06/27/12 | Ingrid: 抽取RNA及RT的條件已經OK，之後的Q-PCR請小嬿幫忙。 |
| 07/04/12 | Ingrid: Turbidity Water ER Ab (1-320aa) 第六針的titer比第四針更好，與 Argene Ab相當，建議用於WB時以1:10,000稀釋使用。 |
| 07/04/12 | Ingrid: 已通知要犧牲採血100ml，建議分裝儲存於-80度冰箱，拿一小管於-20度冰箱中經常使用(此管可加glycerol，因為要反覆解凍)。 |
| 07/11/12 | Ingrid: NP460hTERT細胞生長變慢，懷疑是KGM Gold或是HyQTase的問題，正在測試中。 |
| 07/25/12 | Ingrid: 持續觀察KGM-Gold medium對NP460hTERT的影響 |
| 08/01/12 | Ingrid: 以NP460hTERT感染Akata EBV後,做不同時間點的Rta及Zta的WB沒有結果(細胞數少, infection rate不佳?~15%) |
| 08/01/12 | Ingrid: 而IFA的條件仍在調整中。 |
| 08/22/12 | Ingrid: 調整Rta(LTK)及Zta(LTK)的IFA條件 |
| 08/01/12 | Ingrid: Establishment of NP460hTert_akata EBV cell lines. |
| 08/01/12 | Ingrid: Optimization of IFA in Dox-treated TW01-ERGV cells by using Rta and Zta antibodies |
| 09/05/12 | Ingrid: The infectivity rate of TW01ERGV-produced EBV on NP460hTert was very poor. |
| 09/26/12 | Ingrid: WST-1 of OSCC cells treated with different conc. of PD173074 |
| 10/03/12 | Ingrid: Growth inhibition assays of PD173074-treated OSCC cells |
| 10/31/12 | Ingrid：Growth inhibition assays of Glivec-treated OSCC cells |
| 11/07/12 | Ingrid：WST-1 assay of Glivec-treated OSCC cells at different timepoints with different concerntrations |
| 11/28/12 | Ingrid：WST-1 assay of OSCC cells treated with Glivec for 72hs. |
| 11/28/12 | Ingrid：WST-1 assay of OSCC cells treated with PD173074 for 72hs. |
| 12/11/12 | Ingrid：Proliferation inhibition assay of C9, OEC-M1 and SW780 treated with PD173074 (Selleckchem) for 72hs. |
| 12/18/12 | Ingrid：將細胞種於6 well plate，處理PD173074共48小時(加藥時，medium中已含有0.5%DMSO)，人工計數細胞後發現，C9及SW780皆在100nM的細胞數約為NC的65%，而OEC-M1的細胞數不變。 |
| 01/24/13 | Ingrid：利用計數細胞分析PD173074對於細胞生長抑制的影響。 |
| 01/24/13 | Ingrid：同時將細胞懸浮液加入WST-1試劑去測量OD，發現WST-1 assay無法反應出細胞數量的變化，原因仍在研究中。 |
| 03/27/13 | Ingrid: 檢測口腔癌臨床檢體是否有HPV感染。 |
| 04/17/13 | Ingrid: 檢測口腔癌臨床檢體是否有HPV感染 (HPV18_E7 in three leftover samples)。 |
| 04/24/13 | Ingrid: 重訂HPV16_E7 primer來看是否更有效率的偵測到病毒存在 |
| 05/08/13 | Ingrid: pLenti4_flag_ERK156A已構築完成。 |
| 05/15/13 | Ingrid: 檢測口腔癌臨床檢體中HPV感染情形。 |
| 05/22/13 | Ingrid: 經由Nested PCR分析口腔癌臨床檢體，得到HPV-18 E7的陽性比例為55.6%。 |
| 05/29/13 | Ingrid: 經由Nested PCR分析口腔癌臨床檢體，得到HPV-16 E7的陽性比例亦為55.6% |
| 06/05/13 | Ingrid: 建立pLenti4_flag_ERK156A質體及問題排解。 |
| 06/19/13 | Ingrid: 驗證HPV16/18感染之25例口腔癌臨床檢體。 |
| 10/30/13 | Ingrid: 進行第2批的16組口腔癌臨床檢體的HPV-16 E7及HPV-18 E7的nested PCR |