LabMeeting-小丸

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LabMeeting-小丸
由 EVKVLIN 在 二, 03/25/2014 – 00:00 發表 LIN Lab 2016 LabMeeting maruko 小丸
2008/09/09 Lab Meeting 心得彙整

Maruko:要不要考慮這個跟這個,還有一個這個.
另外S186A是一個至今仍然未解的有趣mutant. 它可以bind DNA,可以transactivate一些promoter,有被訂出in vivo是被PKC磷酸化,但似乎此位點磷酸化的有無與disrupt latency無關.所以此例子並不適合追太久..
2008/09/16 Lab Meeting 心得彙整
Maruko: (1) 為確保293TetKR中仍是每個細胞均具有transgene,小丸子成功地以flow demonstrated that, although weak, but Dox treated 293TetKR homogeneously shifted the anti-flag staining (1:50) to the right (not seen in 1:100 staining). 這樣子的結果可以讓我們安心的繼續使用這個細胞株.當初其實很怕是部份細還有KR,部份細胞則沒了,而以immunoblotting 又分不出來,所以小丸子勇猛地做這個實驗(熱烈鼓掌 霹靂啪啦 霹靂啪啦)智者常言:打鐵趁熱,所以讓我們也篩一下ER.能否請小蓮協助/學習小丸子把手中的293TetLuc及TetER也做一次這樣的實驗,我猜KR不幸是最弱的表現者. (2) GAL4 antibody 確定再訂一支同廠牌新貨. (3)下週決定CDK IP-kinase assay 事宜.
附註: (1) 類似的兩片immunoblot如果出來的intensity不同(如一樣是20 ug protein,染b-actin時一片強一片弱),大家要考慮(用你的左腦)是不是transfer efficiency不同?還是blocking/hybridization不同(buffer盡量蓋滿)?還是ECL呈色時心有所偏 (solution盡量蓋滿)?還是還有其它原因?為Lab/地球省資源是一件美事,但是將錯就錯凡事推給我也不知道,然後再發表了沒有人可以 repeat的結果,那就是我們的不對了.所以請大家運用智慧該省則省,該用則用,切莫因小失大. (2) 293 transfection不佳一事,持續追縱/探討中.有任何想法請隨時提出討論. 謝謝!
2008/09/23 Lab Meeting 心得彙整
Maruko:陷於DLR rellina 深淵中啊.. (不過報得很清楚喔 圖美,簡捷明瞭,讚!)
PS: 昨 晚狂掃所有KR做activation的paper 及十多篇Sp1在JBC上做luciferase assay的paper,發現activator:reporter的量竟然是在3:1 ~1:5之間. 只有韓國一個lab和我們一樣是做1:10. 真是太令我訝異了!讓我們好好測一次ratio吧!
2008/10/07 Lab Meeting 心得彙整
Maruko:Flag- IP有初步結果,繼續微調其它調件;latency disruption籌劃中;全長的pLenti系列DLR操作完畢,等待機器修復中;slide上那個”pAN-Luc”要改為PANp-Luc或 PAN-Luc(這是學他們做ChIP-chip的人們說的)PAN stands for polyadenylated nuclear 是本人10年前花了好幾個晚上想出的名子,請務必保留…(另外一個UCSF group想出的叫nut=nuclear transcript=T1.1,我覺得我的小孩名子叫起來比較好聽耶.嘿嘿嘿,老灰阿說起歷史就停不下來,sorry)
2008/10/14 Lab Meeting 心得彙整
Maruko: 利用293/KSHV做transient transfection,收72h的細胞做Flow紅光測試(還要扣掉背景值、綠光瀰散過來的值,小丸子你實在太強了)。366/367EE呈現稍降情 形,634/636AA則有明顯defect。準備重復此實驗,並加收96h的sample。DLR部份實驗幾近完成。全力搶攻CDKs(still looking for papers of VP16, tat and P-TEFbs, Sorry. Will let you know once I found them)。
2008/10/21 Lab Meeting 心得彙整
Maruko: 利用293/KSHV做transient transfection,收72h的細胞做flow紅光測試。366/367EE呈現稍降情形,634/636AA及NLSm則有明顯defect。另 一半細胞(1/2 well of 6-well plate)做KbZIP western analysis, 除NLSm外餘符合flow data。
2008/11/18 Lab Meeting 心得彙整
Maruko: 利用293/KSHV, 293FT/KSHV, KRKV-, KRKV+做disruption latency的實驗,收72h的細胞做flow紅光測試。634/636AA有明顯defect。雖然重新解凍的293/KSHV background紅光有明顯降低,但還是以293TREx細胞效果最好。Flow 技術真是已達爐火純青的地步,於此再讚美一下!293FT/KSHV那一組KbZIP western 結果符合flow data (請記住NLSm無論何時一定放在整組實驗的最旁邊。為什麼呢?因為NLSm偷偷進核的現象與原因有待天才型科學家來解決,在那一天來臨之前大部份有關它 的實驗數據都不將被列為”可發表”、是會被隱藏的)。
2008/12/10 Lab Meeting 心得彙整
Maruko: (1)整理出PANp/full-length與pFR-Luc/GAL4_TA系列的DLR結果(真的是辛苦你了)。很conclusive的結論有 (a)S634/S636的絲胺酸比S644/652重要,(b)634/636dm誘導溶裂期功能比wild-type顯著降低。為了對mass- spectrometry訂出的細胞質內磷酸化位點513及514有個交待,請把那一部份的結果也整理一下,謝謝。 (2)513及514誘導溶裂期功能發現是較wild-type略低(both in 293 and 293TRex),是因為新prep的plasmid的關係嗎?檢查中。(3)CDK5及CDK9 IP部份還是沒有顯著結果。推測可能與(a)wash buffer (b) quantity of starting material (c)wrong guess to begin with. SFL正用力推敲中…
2008/12/16 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:檢測KR與mutant穿染至293/rKSHV或293Tet/rKSHV中,各個下游基因的表現情形。KbZIP結果最符合Flow/PANp的結果,ORF59與K8.1效果不佳。著手以IFA測試ORF59之表現。
2008/12/23 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:Set up IFAs for ORF59 and K8.1.
2008/12/30 Lab Meeting 心得彙整
Maruko:以ORF59IFA作為另一個比較KR及634/636AA誘導細胞再活化之能力的測試。
2009/01/06 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:開使測試DRB與Roscovitine.
2009/01/20 Lab Meeting 心得彙整
Maruko:繼續CDK9抑制劑對KR轉活化PANp及蛋白質穩定度之影響。
共用培養液遭污染,開始分家?要不要一起來清一下冰箱?因為它實在太小了…
2009/02/03 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:Ectopic expression of KR is stablized by Roscovitine and DRB while transactivation of PANp is inhibited by both inhibitors.
2009/02/10 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:(1)513/514點的DLR圖確定。(2)DRB/Roscovitine對KR-mediated PANp之影響(我給你稱讚有做634AA的control)。
2009/02/17 Lab Meeting 心得彙整
Maruko:DRB/Roscovitine對KR及634/636之影響確定。
2009/03/03 Lab Meeting 心得彙整
Maruko:整理513,514 RLU結果,報告CDK9對S634/636之影響。考慮以更多kinase inhibitors來找出phosphorylate S634/636之kinase(s)。
2009/03/24 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:一系列的藥物篩選,為了找出S634/636的主要激脢!加油,有點影子囉!
2009/03/31 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:Systemic inspecting the effects of various kinase inhibitors on KR molecular weight and protein stability regulation.
2009/04/07 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:整理U0126及JNK pathway對KR molecular weight shift所造成的可能影響。
2009/04/21 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:Flow cytometry analysis of dox-treated EREV8. 病毒歡喜再活化的環境應該是…
2009/05/05 Lab Meeting 心得彙整
Maruko: Titrating KR polyclonal antibodies; 整理三條MAPK signaling pathway inhibitors對KR之影響.
2009/06/02 Lab Meeting 心得彙整/KR磷酸化更新
2009/01/29 SFL wrote：論文大綱:
A) 先前合作實驗室發現EBV Rta在細胞質內具有活性,因此想要測試K-RTA是否在細胞質內亦具有功能。所以根據電腦NLS預測程式構築三株可能會導致K-RTA留在細胞質內的 NLS 突變株,分別是NLSm, NLSm1, 及NLSm2。結果顯示只要將位於527-530的KKRK變為AAAA,K-RTA就會大部份被trap在細胞質內(IFA結果),以western看 時KKRK這個位點的突變似乎會造成蛋白質表現量較多,而且會有明顯的一條小wt大約14kDa的band出現。猜測是核內PTM之故。
B) 欲進一步研究NLSm之功能,構築293TetKR及293TetNLSm Dox-inducible cell line。由這兩株細胞株的KR及NLSm做subcellular fractionation證實114kDa的band一律在nucleus的fraction,而98/100kDa的band則落在細胞質的 fraction。為了進一步瞭解這98/100kDa在細胞質內被磷酸化情形,affinity-purified的NLSm便拿去做LC-ms/ms 分析。結果質譜儀定出兩個可能位點:就是T513和T514(後來拿全長的K-RTA去分析也是定出這兩個位點)。先前Gwack(MCB,2003) 等人報導這T513/T154所在的S/T-rich region和負調控K-RTA的活性有密切關聯。因此我們就做了T513A, T514A, TT513AA的點突變株。但是根據luciferase(PNAp)和latency-disruption的結果發現這兩個位點磷酸化的破壞似乎和 K-RTA的生物活性沒有直接關連。猜測需要破壞更多的該domain磷酸基才能看出和wt的差異。
C) 同時,以phospho kinase-substrate software則比對出另一段和cellular NELF-B具高度相似性的區域。在這個區域中變掉2個胺基酸則大幅度降低K-RTA的分子量及活性(luciferase和latency- disruption)。
New on 6/2/2009:  D)CDK9 inhibitors抑制部分KRTA活性(但同時也會抑制S634A/S636A活性, 所以作用位點可能不在,或是不止這兩個Ser). E)KRTA S634A/S636A are both ubiquitin-modified.
2009/06/10 Lab Meeting 心得彙整
小丸子: (1) phosphorylated S636 antibody seems to be a good one, 但要解決雜band問題.建議購買gradient gel看看有沒有辦法分開. (2)MG115抑制proteosome之過程可讓KR degradation減緩.
2009/07/02 Lab Meeting 心得彙整
小丸子: Detection the amount of Ser/Thr phosphorylation in IP-purified KR, S634A/S636A and NLSm, suggesting total phosphorylation seemed to about the same among these three molecules.
2009/07/15 Lab Meeting 心得彙整
小丸子: Confirmation of CDK9-KR interactions by Co-IP (機會來了,請繼續撐下去!).
2009/08/11 Lab Meeting 心得彙整
Maruko: (1) 繼續奮鬥KR與CDK9 co-IP情形. (2)CIP處理過的KR, NLSm, S634A/S636A都可被p-T, p-S之抗體辨識. 懷疑either CIP 不完全,或是p-T, p-S之抗體不好.(辛苦你啦,又要IP又要CIP才能看結果,不簡單呀!)
2009/08/25 Lab Meeting 心得彙整
Maruko: (1) 再度呈現KR與CDK9 Co-IP之鐵證. (2)探討KR與S634A/S636A差了近10 kDa是否因形狀結構不同所致?
2009/09/08 Lab Meeting 心得彙整
Maruko: KSHV meeting行前rehearsal.
2009/10/27 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:整理S634D/S636D分子量、DLR activity及CIP結果.
2009/11/17 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:整理KR, S634A/S636A,S634D/S636D分子量、phosphorylation程度及CIP結果. 很接近終點了,加油,加油!
2009/12/01 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:整理KR, S634A/S636A,S634D/S636D分子量、phosphorylation程度及CIP結果.
2009/12/22 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:整理KR, S634A/S636A,S634D/S636D分子量、phosphorylation程度及CIP結果.
2010/01/05 Lab Meeting 心得彙整
小丸子:報Paper (這裡), 有關reactivate EBV的四種方式. Great Job, Thank you~
2010/01/19 Lab Meeting 心得彙整
小丸子: 以磁珠操作IP以證明KR與CDK9有interaction結果.
2010/03/02 Lab Meeting 心得彙整
小丸子: 初步觀察P38, JNK, PKC inhibitors對於K-RTA transactivated PAN promoter的影響，發現只有JNK inhibitor有些微的抑制作用；p38 inhibitor有些微促進作用。利用anti-CDK9 IP實驗證實CDK9 associated with K-RTA。
2010/04/06 Lab Meeting 心得彙整
小丸子: 介紹新計畫: Expression profiling of PTKs in Taiwanese OSCC cells。
2010/04/20 Lab Meeting 心得彙整
小丸子: Validate the expressions of AXL and EGFR in OSCC cells。Literature search of AXL, very good!
2010/05/11 Lab Meeting 心得彙整
小丸子: Literature search of DDR1, very good!
2010/05/26 Lab Meeting 心得彙整 (未來目標)
小丸子: (1) shRNA knock-down PTKs in OSCC cells. (2) revise paper for another submission.
2010/06/15 Lab Meeting 心得彙整
小丸子: 繼續shRNA knock-down PTK進度. Good Job!
2010/07/13 LabMeeting 心得彙整
小丸子: shRNA-mediated knock-down of AXL, DDR1, EGFR and FGFR3 in four Taiwanese OSCC cells. Beautiful results!
2010/07/27 Lab Meeting 心得彙整
小丸子: Growth inhibition and Wst-1 assay of OSCC cells with PTK knockdown。
2010/09/01
整理抑制DDR1的表達對於四組oral cancer cells生長的影響。初步結果發現DDR1 mediated oral cancer cells生長是collagen independently。
2010/10/06
整理silence DDR1對於四株口腔癌細胞生長之影響及發現臨床用藥Glivec(an inhibitor of DDR1)會抑制口腔癌細胞之生長…
2010/10/14
報告DDR1 對於 台灣oral cancer cells扮演的角色之相關實驗整理．．
須在加強的部分包含：
導言強調台灣地區口腔癌的特異性．．
Glivec所抑制的一群PTKs 在Glivec使用濃度上的相關性．．
並再討論DDR1在oral cancer cell裡所mediated survival pathway
討論　檳榔對於collagen及DDR1　是否有扮演什麼樣的角色．．
還有　要再有自信一點　講出來！！
下週再繼續．．辛苦大家了．．
2010/10/21
繼續報告DDR1 對於台灣的oral cancer cell lines的重要性
並再討論 DDR1 mediated cell growth可能會經由 MAPK surivial pathway
及嚼檳榔和 OSCC大量表達DDR1的關聯性
再度謝謝大家
連三周 被我疲勞轟炸 及給我的寶貴建議
2010/10/27
整理departmental seminar時 大家的問題與建議
接下來要進行的部分:
1. DDR1是否是constutively active form
2. 延長shDDR1給予時間 觀察細胞反應
3. 不同稀釋之病毒液 是否能有dose的抑制效果 或要選擇不同的shDDR1 clone
4. 加入其他oral cancer cells
2010/11/24
1. 除了OEC-M1以外 其他的口腔癌細胞株都沒有mycoplasma的污染
2. 多株口腔癌細胞株DDR1表達量之比較
3. shDDR1及Glivec對於非台灣地區 口腔癌細胞的影響
4. 持續測試OSCCs之DDR1 activity (phospho-Tyrosine status)
2010/12/22
1. 成功移除OEC-M1內的mycoplasma
2. 比較多株口腔癌細胞DDR1 autophosphorylation的情形 初步結果顯示台灣地區口腔癌細胞株的DDR1 tyrosine phosphorylation的程度較高
3. 一系列K-RTA vs. CDK1,2,6,9的in vitro kinase assay 仍須再試條件 讓結果更明顯 希望會成功!!!
2011/01/12
報告英國Sahai先生兩篇collective cell migration的paper。2007年這篇是 他們建立3D culture system研究squamous cell carcinoma (SCC)的collective invasion，他們發現，cancer associated fibroblast具有帶領一整群SCC invasion的能力。而cancer associated fibroblast會造成matrix remodeling及”track”的形成，以幫助SCC invasion，而這是經由integrin a3、a5、Rho-ROCK路徑。
2011這篇延 續2007年的發現，進一步詳盡探討SCC的collective invasion，他們發現要發生collective invasion時，cancer cell的actomyosin (包含F-actin, phospho-MLC及MyosinⅡa)會reorganization。他們觀察到癌細胞與細胞間的actomyosin的活性都是明顯下降的，並 進一步發現DDR1會參與actomyosin活性的調控，而DDR1調控collective invasion與它已知的ligand ”collagen”及它的kinase activity沒有太大的關聯性。利用GST-pull down發現DDR1會與Par3及Par6的PDZ domain形成complex，並進一步影響RhoE的分佈，而影響ROCK driven的actomyosin活性，因此，一但阻斷DDR1/Par3/Par6，SCC的collective invasion則會被中斷。本篇提供了DDR1/Par3/Par6在SCC的collective invasion時可能扮演的角色。
2011/01/19
報告進度:
1. 利用外送PCDNA3-Flag CDK9, PCMV-Flag2-DN-CDK9及PIRES-hrGFP-cyclin T1進行K-RTA的in vitro kinase assay, 初步看到KRTA被CDK9磷酸化,而DN-CDK9則不具有這樣的能力
2. silence DDR1後對於oral cancer cells生長曲線的影響
希望快快將data補起來!! 加油!!
2011/02/16
1. CDK9 Kinase assay結果顯示 CDK9會磷酸化K-RTA 而S634/S636是其中一個位點
2. 初步看出來 K-RTA會被anti phospho-Ser/Thr-Pro MPM2所認識 而與 Pin-1間的交互作用仍需進一步證明
3. 完成silence DDR1對於口腔癌細胞株生長的影響 (DOK, HSC-3, OEC-M1, SCC-15, TW2.6)
2011/03/09
1. 共同表達K-RTA與Pin1後發現, 大量Pin1表達會造成 K-RTA降解
2. 初步結果顯示 K-RTA與 Pin1間有交互作用, 但需加入IgG控制組
3. 完成silence DDR1對於口腔癌細胞株生長之影響
2011/03/30
1. 利用coexpress Flag-K-RTA及Flag-CDK9的lysates 進行CDK9 IP實驗 結果發現K-RTA, S634A/S636A, NLSm均與CDK9有interaction, K-RTA與CDK9的association較S634A/S636A強      2. Pin1 isomerase mutant K34A與K-RTA大量共同表達 K-RTA的molecular weight並沒有改變, 初步推測 Pin1的isomerase的活性並不會影響K-RTA的molecular weight
2011/04/20
1. 利用 Nu-PAGE gel跑出的IP結果不佳
2. 整理K-RTA 磷酸化paper投稿至JV後reviewers的意見
3. 結果發現CDK9會磷酸化K-RTA 而 S634/S636是可能的位點 但是加入DRB 不會影響K-RTA的分子量 期望能找到合理的解釋
4. 大量表達Pin1會造成K-RTA蛋白量降低 而Pin1 inhibitor與 shPin1似乎也會影響K-RTA的表達 量 因此Pin1對於K-RTA stability的影響 需要進一步探討 才能定論(不知道是否因為Pin1 inhibitor或shPin1影響polII的activity呢?)
2011/05/18
1. 利用黃老師家學姊提供之unknown cancer tissue sample進行DDR1之IHC練習
2. 試著釐清Pin1對於K-RTA蛋白質穩定性的角色及對於K-RTA transactivation ability的影響
~~但結論仍在一片渾沌中~~
3. DNCDK9對於K-RTA transactivation ability有抑制的效果 但仍不能排除 DNCDK9是全面性抑制了transcription
2011/12/21
1. 再次整理Pin1對於K-RTA的影響, 結果顯示Pin1會結合至K-RTA 並且影響K-RTA之穩定性, 而Pin1結合至K-RTA是經由其WW domain, 且isomerase activity也貢獻於pin1與K-RTA之交互作用
2. 此外, S634A/S636A被anti-MPM2結合的能力較差, 表示S634/S636可能是Pin1所結合的位點
3. Pin1對於K-RTA活性的影響 則尚未釐清
4. 完成oral cancer tissue array (OR2081)的DDR1染色
2011/06/15
1. 再次整理Pin1對於K-RTA的影響, 結果顯示Pin1會結合至K-RTA 並且影響K-RTA之穩定性, 而Pin1結合至K-RTA是經由其WW domain, 且isomerase activity也貢獻於pin1與K-RTA之交互作用
2. 此外, S634A/S636A被anti-MPM2結合的能力較差, 表示S634/S636可能是Pin1所結合的位點
3. Pin1對於K-RTA活性的影響 則尚未釐清
4. 完成oral cancer tissue array (OR2081)的DDR1染色
2011/07/20
1. 在293FT細胞中共同表達K-RTA, S634A/S636A, Luc (control protein)及Pin1, 結果發現Pin1降解K-RTA及S634A/S636A的能力相似
2. 用一批新抽的K-RTA及S634A/S636A transfection至293FT後發現, K-RTA與S634A/S636A穩定性接近, 推測634/636位點磷酸化與否與其穩定性無關
3. 完成oral cancer tissue microarray (BC34011, HN811)之DDR1 IHC染色, 未來將進行DDR1表達量之給分
4. 整理DDR1之ligans-collagens(type1-5)在一些oral cancer tissues中觀察到他們的RNA level有增加的情形, 最後我們認為在口腔癌中, collagen type1及type4為可能較重要的DDR1 ligands
2011/08/17
1. 在HEK293細胞中共同表達KR, S634A/S636A, Luc及不同量的Pin1, 結果發現大量的Pin1會造成KR, S634A/S636A, Luc蛋白量的降低, 由於Luc已知不會與Pin1交互作用, 因此大量Pin1可能部份造成細胞general的影響了。
2. IP結果初步看到, KR及S634A/S636A會被sumo-1所修飾, Luc則沒有, S634A/S636A被sumo-1修飾的能力較差, 但仍需進一步實驗確認sumo-1修飾KR及S634A/S636A所扮演的角色。
2011/09/14
1. 著手進行三張tissue microarray的DDR1 staining給分
(1) 依顏色深淺給予: 0-3分
(2) 依tumor所佔區域大小給分: 0-3分
(3) 分部位分開計分 (已完成舌頭, 臉頰)
仍需解決的問題是 tumor part的判別~~需要請教別人 並且再多看一些slide 累積經驗
希望早日完成計分 並進行統計分析
2. 學姊建議整理DDR1相關data, 以利之後的方向
2011/10/26
1. 測試anti-DDR1 (Sanat Cruz, C-20) IP條件, 發現增加Ab的量, 並沒有增加IP下來DDR1的量
2. 測試serum free後加入collagens對於DDR1活性的影響, 在T47D這組有看到DDR1的Tyr-phosphorylation增加, 但OEC-M1的結果不同, 推測是細胞太滿之後serum free造成的影響, 因此 必須重新試條件
3. 分析silence DDR1後對於下游訊息傳導的影響, 在OEC-M1及TW2.6走向不同路徑
2011/12/21
日前投稿至Frontiers in Virology的manuscript的初次結果為minor revised
報告三個reviewers的建議, 重點摘要如下:
1. 針對NLS提問, 希望我們討論為何與過去發現不同 (no.1 reviewer)
2. 希望能加做分析KSHV viral particle的產生情形 (n0.1-3 reviewers)
3. 希望我們討論CDK9磷酸化KR的其他可能位點, 還有是否有其他CDKs結合 (n0.1-3)
4. 覺得luciferase assay差異不明顯 (n0.1, 2)
5. 關於KR吸引CDK9後影響Poll2下游的轉錄機制的可能假說, 覺得證據非常不足 (no.2)
6. 提到KR會被IgG所直接binding (no.2)
7. 要我們再詳加解釋S634A/S636A與KR 10kDa的差距是否來自於磷酸化改變 (no.2)
2012/02/15
1. 完成三組tissue microarray的DDR1, collagen type 1及collagen type 4的染色, 初步計分結果, 似乎DDR1的大量表達與collagen type1的大量表達較為相關,而DDR1大量表達也與疾病的grade較相關
2. 比較OSCC cells DDR1 tyrosine phosphorylation的情形, 結果為DOK, C9, OC-3, OEC-M1, TW2.6>HSC-3, SCC-15, T47D>HEK293, 發現DDR1 tyrosine phosphorylation的程度與gilvec對於這些細胞的抑制能力,沒有很好的相關性, 然而發現在OEC-M1, TW2.6, HSC-3, SCC-15這幾組IP DDR1 sample中, 發現約略80-85kDa的DDR1-associated protein有強烈的tyrosine phosphorylation, 但此蛋白為何未知
3.此外 DDR1的活性反映出的下游為何未知 (但排除非p-MAPK及p-AKT)
4.利用Q-PCR分析一系列oral cells的DDR1 isoforms的表達, 結果發現大多細胞只表達1a及1b這兩種isoforms, 而mRNA表達量也與蛋白表達量具相關性
2012/04/09
1. 將DDR1 IP後的interacting proteins (no. 1-4) 切下後訂mass, 而no. 1約60 kDa, no. 2約75kDa, no. 3約85 kDa, no. 4約160 kDa的蛋白質, 其中最有興趣在一些OSCC細胞中可能有高度磷酸化的區域為no.2 利用MASCOT分析的結果統 整出較有可能的protein分別為 Heat shock 70 kDa protein 8, Heat shock 70 kDa protein 9 及 Polyadenylate-binding protein 1, 這些結果進一步需實驗進行驗證
2. 利用OEC-M1處理Glivec後, 觀察抑制DDR1活性對OEC-M1的影響 結果發現細胞生長停止, 但細胞死亡的情形不明顯
3. 觀察K2及K6細胞對Glivec的敏感性, 結果發現Glivec對於DDR1表達量較少的K2的生長抑制效果較差, 此結果仍須重複確認
2012/07/18
1.為了補強DDR1 paper的圖表，重新做了shAXL, shDDR1, shEGFR, shFGFR3的實驗，發現它們對OSCC細胞的生長抑制作用(WST-1 assay)有程度上的差異，其中DDR1在48h對細胞的抑制平均而言可達三成左右。
2.取OEC-M1為cell model，證實Glivec可以降低DDR1 auto-phosphorylation之程度。
3.Collagen type IV處理的HOK及TW2.6細胞中，可見及DDR1表現量增加，其餘細胞的相關實驗則由小夏幫忙檢測中。
2013/01/16
1. 利用pooled shDDR1 clones探討DDR1對於OSCC cells的影響，結果發現抑制DDR1表達造成OSCC cells數目降低及細胞凋亡數目增加，而p-SHC、p-SHP2、p-MAPK、CDK1及bcl2為參與DDR1 pro-survival 路徑的重要分子。2. 比較一系列DDR1 inhibitors (Imatinib、Dasatinib及Nilotinib )對於OSCC cells生長的影響，其中Dasatinib對於OSCC cells的生長抑制效果顯著，但其為廣效型抑制劑，相較之下對DDR1專一性較差，因此，之後實驗仍會著重於Imatinib及Nilotinib當作 DDR1抑制劑，觀察對於OSCC cells生長的影響。3. 利用HOK探討collagens是否會增加DDR1及collagens的protein及mRNA level表達，結果發現collagen typeIV扮演重要角色。
2014/01/15
1. 整理與Harvard Skin Disease Research Center Dr.Rheinwald購買之細胞株培養方法
2. 試著釐清Src與DDR1的活性之關聯性: 過去研究指出(1)Src innibitor會抑制collagen I induced DDR1的活性(2)Src會與p-DDR1有交互作用 我的結果指出(1)imatinib處理會抑制Src的活性 (2)比較不同株細胞Src的活性與DDR1的活性似乎有相關 (3)加入Src innibitor會影響OEC-M1中DDR1與Src的交互作用(此現象在TW2.6不明顯) (4)加入Src innibitor 對於OSCC細胞生長的抑制影響不是很明顯(1uM濃度, 48小時)
3. 整理過去發現Collagens處理後DDR1,ITG..等mRNA level增加的例子, 結論為大多條件均在serum free下進行, 因此會嘗試改變為這樣條件去觀察在keratinocytes中處理Collagens對DDR1及ITGs mRNA level的影響
4. QPCR的CT值差異約要載1.5-2以上 以終產物跑agarose gel 才看的出來差異
Date Title
05/06/12 小丸: Expression patterns of pCDNA3.1-DDR1a/b in HEK293 cells.
05/06/12 小丸: Expression patterns of DDR1 affected by different lysis buffer. 
05/23/12 小丸: DDR1 could interact with HSC70 and GRP75。 
05/23/12 小丸: Tyr-phosphorylation status of DDR1 in Glivec treated OEC-M1 cells。
05/30/12 小丸: WST-1 analysis of four PTKs (AXL, DDR1, EGFR and FGFR3) silenced in Taiwanese OSCC cells。
05/30/12 小丸: Tyr-phosphorylation status of DDR1 in Glivec treated OEC-M1 cells。
06/06/12 小丸: Tyrosine phosphorylation of DDR1 was increased in-Glivec treated OEC-M1 cells! Literature search suggest that briefly Na3VO4-treatment. 
06/06/12 小丸: Literature search suggested that brief treatment of Na3VO4 before cell harvet retained Tyr-phosphorylation in control cells.
06/27/12 小丸: Collagen type IV treatment incrased protein levels of DDR1 in HOK cells.
06/27/12 小丸: Glivec caused down-regulation of phpspho-AKT ( Thr308 ) in OSCC cells.
07/04/12 小丸: Glivec-induced cellular vacuole formation can be inhibited by autophagy inhibitor, Bafilomycin A1
07/11/12 小丸: Glivec decreased tyrosine-phosphorylation of STAT3 and SHP2 in OSCC cells
07/25/12 小丸: Knockdown of DDR1 caused decreased P-SHP2(Y542) in OEC-M1 and TW2.6 cells.
07/25/12 小丸: Autophagy inhibitior had little effect on Glivec-cell growth inhibition.
07/25/12 小丸: Collagen type I and type IV caused DDR1 mRNA level increased in HOK cell.
08/01/12 小丸: To test the plasmid transfection condition of OC-3 cell.
08/08/12 小丸: Tissue microarray analysis of DDR1, Col I and Col IV in OSCC specimens.
08/08/12 小丸: DDR1 and Col IV were significantly highly expressed in grade 1–3 sepcimens.
08/08/12 小丸: High expressions of DDR1 and Col IV were stasticastically correlated in grade 2–3 specimens.
08/22/12 小丸：比較不同細胞滿度 對於DDR1表達的影響 
08/22/12 小丸：Glivec處理對於DDR1蛋白量的影響
08/01/12 小丸：DDR1 protein level did not change dramatically in cells with density 1-2×105
08/01/12 小丸：Glivec處理對於DDR1蛋白量的影響
09/05/12 小丸：DDR1 protein level varied in different density of OEC-M1 cells (1–2 x 10^5).
09/26/12 小丸：完成四株台灣口腔癌細胞株silence DDR1後之signaling變化情形
09/26/12 小丸：利用super lysis buffer萃取glivec treated cells分析DDR1的表達情形
10/03/12 小丸：Silence DDR1後不影響SHP2的表達
10/03/12 小丸：Glivec處理OEC-M1後觀察p-Tyr-DDR1的變化
10/31/12 小丸：Silence DDR1及加入Glivec會影響CDK1表達及活性改變 及cyclin B1累積 進而影響G2/M phase進行
10/31/12 小丸:  Silence DDR1後不會造成EMT的發生(因為 Fibronectin, N-cadherin的量並未上升)
11/21/12 小丸：Glivec處理造成OC3及OECM1的DDR1 mRNA level下降, 但在C9及TW2.6則沒有明顯變化
11/21/12 小丸：愛爾蘭開會之心得已撰寫完畢，連同大會Abstract Book放在電話旁Bench上，歡迎大家翻閱、指教!
11/28/12 小丸：進行DDR1 paper結果撰寫中及構思補強data
12/11/12 小丸：初步測試另外兩支DDR1 inhibitor~Dasatinib and Nilotinib對OSCC cells生長的影響，Dasatinib較Nilotinib敏感。
12/11/12 小丸：預計先進行此兩個inhibitors對DDR1 p-Tyr的IP實驗。
12/18/12 小丸：IP-WB analysis of DDR1 inhibitors treated OEC-M1 cells. 
12/18/12 小丸：Growth inhibition assays of DDR1 inhibitors on OSCC cells.
01/24/13 小丸：測試新的DDR1c-e isofrom primers。 
01/24/13 小丸：補齊shDDR1之signaling pathway之WB 3.以WST-1 analysis觀察Dastinib及imatinib對T47D生長的影響。
01/24/13 小丸：以WST-1 analysis觀察dastinib及imatinib對T47D生長的影響
01/30/13 小丸：完成DDR1 isoforms在4株OSCC cells的mRNA level的偵測 。
01/30/13 小丸：Ingrid進行陳教授家來的Nilotinib對2株OSCC cells生長的影響 初步結果顯示 與購自Selleckchem的藥效果相似。
01/30/13 小丸：觀察imatinib對於4株OSCC cells抑制生長的能力， 不會造成大部分細胞的死亡， 而是讓細胞生長速度受到抑制。
03/13/13 小丸：整理Imatinib處理72-96h後細胞死亡及存活情形並以WB觀察DDR1及先前觀察到之apoptotic signaling
03/27/13 小丸：觀察Imatinib及Dasatinib短時間處理對於DDR1下游分子的影響(1h and 24h)
04/03/13 小丸：整理Imatinib及Dastinib影響之PTKs 。
04/03/13 小丸：分享EGFR抑制劑對於HNSCC之現況。
04/03/13 小丸：Imatinib及Dastinib對於TW2.6之DDR1 p-Tyr status之影響(進行中)。
04/17/13 小丸：以IP-WB驗證Imatinib及dasatinib可以抑制TW2.6細胞DDR1的活性。
04/17/13 小丸：Imatinib及Dasatinib處理OSCC cells可以抑制p-SRC(Y416), 但在knockdownDDR1後 對於p-SRC的影響不明顯 (因為SRC原型下降)。
04/24/13 小丸：To confirm DDR1 mediated signaling pathways are impaired in imatinib/dasatinib treated OEC-M1 and TW2.6 cells.
05/08/13 小丸：Imatinib及dasatinib處理會造成CDK6, cdc2, CCNE2下降。
05/08/13 小丸：小夏進行外加collagen是否會影響Imatinib及dasatinib造成的細胞毒殺試驗發現似乎有保護作用。
05/08/13 小丸：Imatinib或dasatinib加入cisplatin具有加成毒殺癌細胞的能力 (5-Fu待確認)。
05/15/13 小丸：觀察以imatinib及dasatinib處理K2及K6 cells的影響, 結果發現較其他OSCC cells 不敏感。
05/15/13 小丸：觀察以collagens處理K6後DDR1 mRNA的變化, 看起來與DDR1 protein變化不大一致。
05/22/13 小丸：Cisplatin與DDR1 inhibitors共同處理OEC-M1 cells有加成性的毒殺效果, 但5-Fu 則沒有很明顯的效果。
05/22/13 小丸： 黃老師有建議預先處理A 之後wash off 再給予B 可以減少兩種藥物直接的交互作用產生的side effect
05/22/13 小丸：  (也較符合臨床治療時 先給A 再給B 不會同時給病人A+B)
06/05/13 小丸：DDR1_MS Figures、準備需repeat實驗之sample。
06/19/13 小丸：DDR1_MS Figure 5。
07/03/13 小丸：利用shFGFR3 cell lysates測試2隻anti FGFR3 Abs.
07/03/13 小丸：觀察silenced DDR1後, N-cdherin, Fibronectin, FoxO3a的變化.
07/24/13 小丸：在4組OSCC cell lines silenced DDR1後觀察到CDKN1A mRNA的增加, 而CDKN1B則沒有多大變化
07/24/13 小丸：以不同濃度的TGF beta1處理HOK 24h後發現DDR1的mRNA level隨濃度增加而降低
08/07/13 小丸：整理silenced DDR1或抑制DDR1後對4組OSCC細胞生長之影響, 結果發現CDKN1A與CDKN1B上升, CDK1, CDK6, CCNE2下降, 但直接分析細胞週期的分布, 卻發現細胞沒有明顯停在某個phase的情形, 此點仍沒有很好的解釋
08/07/13 小丸：利用IFA觀察4組台灣OSCC cells是否有collective migration的情形(p-MLC, F-actin)
08/07/13 小丸：並利用IFA觀察silenced DDR1後對p-MLC, F-actin及E-cadherin分佈的影響
08/14/13 小丸：於TW2.6加imatinib或shDDR1-IFA (p-MLC, E-cadherin)
08/14/13 小丸：於C9外送DDR1a/b觀察是否幫助collective migration (型態及IFA觀察)
08/14/13 小丸：Clonogenic assay有初步結果 以不同濃度imatinib或dasatinib處理OEC-M1可以看到很明顯的抑制效果
09/04/13 小丸：以IFA觀察TW2.6及A431在knockdown DDR1或加入imatinib後, p-MLC, E-cadherin, F-actin的變化
09/04/13 小丸：觀察A431及SAS的DDR1表達情形
09/04/13 小丸：Summary of clonogenic assays
09/11/13 小丸：以imatinib處理A431後觀察p-MLC及E-cadherin的變化
10/09/13 小丸：整理cologenic assay觀察DDR1 inhibitors對OSCC cells生長影響之結果
10/30/13 小丸：To determine DDR1 activity on collagen I or IV treated OSCC cells
11/20/13 小丸：IP-WB analysis of p-DDR1 in OSCC, T47D and K6 cells
11/20/13 小丸：Transfection and transduction rate of OSCC, T47D and K6 cells
12/04/13 小丸：To test transfection efficiency using lipofectamine 2000 in OSCC cells
12/04/13 小丸：To detect IDO-1 expression in interferon-g treated K6 and OSCC cells
12/18/13 小丸：Collagen I及IV會增加HaCaT 之DDR1表達
12/18/13 小丸：在K6 silence DDR1之表達會影響少部份細胞生長
12/25/13 小丸：Clonogenic asaay of DDR1 inhibitors treated OSCC and T47D cells.
01/08/14 小丸：觀察以COLI或IV處理HOK, K6或HaCaT對於DDR1, ITGs的影響 
01/08/14 小丸：觀察silence DDR1後對cell growth related genes mRNA level的影響 
01/15/14 小丸：Progress Report
01/22/14 小丸：觀察以COLI或IV處理HOK, K6或HaCaT對於DDR1, ITGs的影響  整裡3D culture相關實驗方法
02/26/14 小丸：1. OKB2之doubling time及形態 
02/26/14 小丸：2. 在serum free下觀察collagen I及IV對K2及K6 cells中DDR1的影響
02/26/14 小丸：3. TW2.6 及OEC-M1cells spheroid invasion條件測試
03/25/14 小丸：1. 觀察OKB2及OKF4/hTERT處理collagen後DDR1的表達量及p-MLC分布情形是否受到影響
03/25/14 小丸：2. 計算OKF4/hTERT的doubling time (大約26-32h)

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