LabMeeting-小夏 – WWW Domain

LabMeeting-小夏
由 EVKVLIN 在一, 04/07/2014 – 10:30 發表 LIN Lab 2016 LabMeeting natsumi 小夏

2008/09/16 Lab Meeting 心得彙整
小蓮:sip21/sip27 其實都蠻成功的.請再repeat一次這組實驗(去掉gapdh後共六個sample,seeding sample時細胞數目要算對,記住搖勻(前後左右,而非順/逆轉, wagada?)si轉染部份照舊,五個要加Dox,Dox加後6~9天內做綠染) Pusa bless you.

2008/09/23 Lab Meeting 心得彙整
小蓮:微調ERKV/rapa調件,重複HONE1/ER transient transfection (除了western外, wst-1會重做嗎?),還有,我們算講完了嗎?

2008/10/14 Lab Meeting 心得彙整

小蓮: Rapamycin對ERKV似乎有正向作用,黃老師建議思考mTOR可能是宿主細胞反制病毒活化的機制之一, 現在block住它,virus活化得較高興.這是很有意思的論點,要記住. siRNA繼續調條件中,HONE1補作ER實驗似乎okay. Slide做得很好(可是最後一張圖下方忘了加lane number,加上去就可與左邊說明相乎應). Good.

2008/10/21 Lab Meeting 心得彙整

小蓮:HONE-1 transient transfection的rH2AX及actin待補齊,也期待paper被review得順利☺。 mTOR pathway對ERKV reactivation似乎是抑制作用而非加成。建議再跑一、二片新膠確定p70S6K有被抑制、KR/p21/p27/ER有沒有出來(用NTU的抗體,因為1ng/ml的Dox24h可提引出的Rta可能不多。原來那片blot,請留給下週BioRad新機demo時用flag染,配套他們的超強 ECL試劑和儀器,看做得出來嗎)。 si-p21/p27部份保持這一次INTERFERin三天,然後dox三天的步驟(L2K同樣條件下似乎toxicity較強一些)。另一盤 duplicate留做老化綠染用(Good)。Hoeffer SE260請代為清點現有、賒借、欲加購的所有項目,謝謝。最後,ERKV靜置5天的lysate中flag-ER並沒有spontaneously lytic情形《註,旁邊是1ng/ml dox 24/48h結果,所以比較淡》。

2008/11/04 Lab Meeting 心得彙整

小蓮:si- p21/p27部份以INTERFERin三天,然後dox三天的步驟做western blot analysis。 Dox-treated control組p21表現比siNeg還低,原因不明。綠染實驗仍在等待中…(那10/21那一批後來是怎樣的結果呢?好奇…)

2008/12/10 Lab Meeting 心得彙整

小蓮：總整理前面多次 siRNA條件(七、八次有吧,希望對你也有幫助,大力感謝)。基本上Ambion design的validated si-p21, p27都很不錯。搭配網路上廣作宣傳的siRNA transfection reagent, si24小時後加Dox那一組的條件應該是okay的。另外siNeg的怪現象看起來也是可以克服的。目前就是把新買來的染劑先確立可以染出東西,然後再回頭做一次si24小時後加Dox的條件,不管能不能重複,這部份實驗就此完成。Rapamycine對KV似有一些加成功能,但是沒有dose- dependent,而且機制不明。這部份請把flag-ER/actin補完後,也是可以暫告一個段落。倒是趁 Flag-ER細胞還在時,來做一個reviewer建議的高濃度怎麼樣(100,200,400,800nM)?也是以10 uM的LY294002為control。

開始來問幾個問題,第一有病毒在時,cell也是停在G1嗎?有病毒在時p21,p27,CCNE,CDK4, CDK6, CCND1表現如何呢?在細胞核裡sub-cellular localization有沒有變化呢?

2008/12/16 Lab Meeting 心得彙整
小蓮:緊急幫忙SFL做一組rapa的實驗給Prof. Misha Blagosklonny(第一次被外人國人主動邀請當collaborlator耶,要好好做!).主要是將rapa濃度提高,並加做 S6K(T389)及pS6(S240/244)之測試。TOR到底對病毒再活化是弊是利,加做這組實驗應該也會幫助瞭解.

2008/12/23 Lab Meeting 心得彙整

小蓮:測試高濃度rapa對senescence之影響。

2008/12/30 Lab Meeting 心得彙整

小蓮:設計實驗測試正常細胞和老化細胞的“胖度”差異;測試ER的細胞生理功能是否為可逆反應;ER對metabolic stress(=serum starvation)的反應以及U0126對老化的影響。

2009/01/06 Lab Meeting 心得彙整

小蓮:以pS6證明即便是高濃度的rapa確實對ER-mediated senescence都沒有效果。(所以可否把今天報告的圖上傳至nas給我,謝謝)

2009/01/20 Lab Meeting 心得彙整

小蓮：LY, rapa, U0126對RTA綠染之比較、著手irrversibility測試條件。

2009/02/10 Lab Meeting 心得彙整

小蓮:(1) 有無serum 似乎對RTA induced綠染沒有影響(照相時有沒有辦法把大小、胖瘦、死活、真假綠染再分清楚一點?)。(2)準備細胞找出讓RTA表現可以被reverse回來的點。(3)能否把張博士給的protocol和我們過去做的列在一起比較異同,下次在lab meeting中與大一家分享一下。因為日後會常以si來做functional assay,所以這個把技術非建立起來不可(附註:我覺得你過去做的其實也是成功的,只是我們看的點較長,而且又有細胞停在G1的影響)。

2009/01/12 (細胞老化和病毒再活化)

這部份實驗是承接293TetER之後的故事,我希望剛開始的一些結果可以當做小嬿的論文。小蓮請先協助,小丸子與Ingrid在忙完KR後也要漸漸加進來,希望能夠把這部份的因果關係釐清清楚。以EREV8而言雖然和293TetER所表現flag-ER的量是相似的,但是因有病毒基因套在裡面,所以估計還不到SA-b-Gal最強的第十天,細胞可能因病毒大量製造的摧殘就掛了。ERKV可能也是如此。所以,我們要弄清楚什麼呢?
⓵Dox-treated 293TetER停在G1,那有病毒的細胞呢?
⓶Dox-treated 293TetER在serum-free這個stress存在下細胞巨觀並未如對照組產生顯著變化,而且病毒再活化時,在48小時以後細胞明顯變圓。再來,microarray顯示Rta或Rta+EBV或Rta+KSHV均會讓一群控制細胞架構的基因表現異常。另外,小龜的結果又顯示ER一表現可持續活化Erk(一個和cytoskeleton有密切關連的分子),這些線索之間相互間的關係到底是什麼?
⓷Dox-treated EREV8和ERKV有走完裂解期嗎?製造出來的病毒有感染力嗎?效價好嗎?(小嬿你真的要準備吃大餐了)
⓸另外幾組異常表現的基因如DUB/protease,chromosome binding protein等,如何和老化及病毒再活化連起來呢?
⓹細胞老化已知的pathway(growth arrest, activation of mTOR, secretion of mitogenic/antiapoptotic factor, activation of proteosome)可提供病毒什麼好處、讓它引發lytic cycle?

2009/02/24 Lab Meeting 心得彙整

小蓮:U0126確實對Rta mediated growth arrest及senescence有明顯抑制現象(猜測一:Rta須靠ERK1/2下游的分子(ELK, Ap1 etc)共同執行功能;猜測二:Rta是ERK1/2的substrate!像這個)、繼續進行測試不同dox及時間對Rta reversibility之影響、幫忙理出siRNA protocol。(另外你早上提及ERK1/2與mTOR相關性在這裡,不過一般而言若上游的藥(U0126)有效,那下游的藥(rapa)應該也會有效才對)。

SFL3: 小蓮請注意,這次小丸子報告中,那個和U0126相似,卻還沒有達到effect的藥,是不是可以幫忙查一下劑量,看看是否也可抑制ERKV reactivation?

小夏3/26/09, 10:02 AM收到! 我偷偷染kv的綠染(5days)，幾乎每個細胞都綠ㄟ。

2009/03/17 Lab Meeting 心得彙整

小蓮:(1) Ir-reversibility point for 293TetER is 5 ng/ml for 24 hr. (2) U0126 (10 micrograms/ml) inhibited three biological functions of Rta, namely p21 induction, growth arrest and SA-b-Gal staining. (3) M.W. decrement of Flag-Rta upon U0126 treatment (待查)

2009/03/31 Lab Meeting 心得彙整

小夏: ER mediated KV reactivation is also inhibited by U0126.

2009/04/14 Lab Meeting 心得彙整

小蓮:Flow cytometry analysis of Dox-treated 293TetER and EREV8; Western blot analysis of U0126/dox-ERKV.

2009/06/02 Lab Meeting 心得彙整

小夏:與小丸子合作,第三次以flow cytometry分析代數較早之EREV8被dox活化後cell cycle分佈情形,但結果與前兩次並不相同,細胞有停下來,但是不會死.

2009/06/23 Lab Meeting 心得彙整

小夏: Progress report on expressions of H2A, H2B, H3 and H4 in Luc/Rta/EV/KV/KR cells.

2009/07/08 Lab Meeting 心得彙整

小夏: Progress report on expressions of H2A, H2B, H3 and H4 in Luc/Rta/EV/KV/KR cells.

2009/08/04 Lab Meeting 心得彙整

小夏: Cell cycle analysis of Dox-treated EREV8 (完整版); PARP cleavage can be detected in virus-replicating cells. RFP/GFP可被methanol滅掉顏色耶!要來做一次看看嗎? (這叫永不滿足的科學家嗎?)

2009/08/18 Lab Meeting 心得彙整

小夏:(1) 以 caspase 3 cleavage的western blot analysis證明EREV及ERKV中apoptosis的現象。(2)MeOH固定可有效 wipe-out (denature) GFP/RFP!著手籌劃ERKV的cell cycle analysis。但Phil提醒如此一來,細胞將變得較黏稠,宜以含FBS之PBS做往下之實驗。comments: (SFL) 這麼一說,我覺得是BSA才對.所以我繼混淆小夏&小嬿,CO2&liquid N2,藥品間&TC room後,又新加了一項痴呆紀錄.我完了。(小夏)OK~ I got it~ 謝謝學長的指教感激不盡 (phil) I don’t remember I said FBS or BSA during the meeting. But 2~3% BSA in PBS should be working. Of course, FBS is definitely a good (and luxury) choice for blocking ^.^

2009/09/08 Lab Meeting 心得彙整

小夏: 以methanol固定來denature dox-treated ERKV 中的GFP/RFP! ERKV的cell cycle於是大功告成 (太帥了)！

2009/10/13 Lab Meeting 心得彙整

小夏: Cell cycle analysis of Dox-treated ERKV (最終話) – Good Job!

2009/11/03 Lab Meeting 心得彙整

小夏: 偵測KR及OGlcNAc mutants 糖化情形. 293T似乎表現許多pLenti4系列質體所表現的蛋白質.

2009/11/24 Lab Meeting 心得彙整

小夏: 偵測KR及OGlcNAc mutants 糖化情形. Flag-珠珠很好用,但input的量很難猜…

2009/12/01 Lab Meeting 心得彙整

首先要謝謝小夏早上幫忙把眾人的細胞從僅剩二點多CO2的培養箱中救出.維修人員「保證」這次再有問題,他就….請太平洋氣體公司再來一次 (無言啊..)

2009/12/15 Lab Meeting 心得彙整

小夏: K-RTA確實與PARP-1有交互作用. 因PARP-1所造成的PTM也是suppressive effect,所以目前結果似乎相當完美,希望能repeat這一個結果.

2009/12/29 Lab Meeting 心得彙整

Hammerschmidt的新作在此.

小夏: 報paper: EBV/p2089 facilitates the tumorigenecity of 293 這裡 .

謝謝你們! Good Job, 希望自己也有收穫(不懂處,讚嘆處,崇拜處,不認同處..請多利用comment來討論,下年度我們幾乎都會玩到這些東西,所以講者聽者都可以踴躍發言)

2010/01/12 Lab Meeting 心得彙整

小夏: Finalized OGlcNAc Fig 6. Great!! Thank you~

2010/01/26 Lab Meeting 心得彙整

小夏: EBNA1及MN-trial 1: both not so significant in TWO3 and HONE1!

2010/02/23 Lab Meeting 心得彙整

小夏: EBNA1及MN-trial 2: 時間延長至48h, 加入LMP1為positive control. Still not so significant in TW03!

2010/03/09 Lab Meeting 心得彙整

小夏: Rta與ERK之關聯性研究一: IP-western之初步實驗結果顯示二者在293細胞中似有交互作用。Very good!

2010/04/13 Lab Meeting 心得彙整

小夏: U0126在抑制Dox-treated 1B2也有效,往下focus在TWO1-EREVp2089,並加入TS, TS/U0126組別。

2010/05/04 Lab Meeting 心得彙整

小夏: U0126對Dox-或TS-treated TWO1-EREVp2089之抑制狀況。(建議:下次這樣的data(濃度似乎和293不同,Flag-ER表現受到抑制)也可以報告啊,盡量不要重複已經報過的data。Introduction除外)

2010/05/26 Lab Meeting 心得彙整 (未來目標)

小夏: U0126是否抑制Rta-mediated EBV reactivation in TW01EREVp2089_S.

2010/06/01 Lab Meeting 心得彙整

小夏: 報paper, Zta transiently aguments p53. 謝謝~

2010/06/08 Lab Meeting 心得彙整

小夏: SA-b-Gal staining of TW01TetER #7, 16, 19.

2010/07/13 LabMeeting 心得彙整

小夏: Characterization of TW01TetER #7 and #19, part I: expression kinetics of Rta, MYC, CDK6, p53, p21, p27 and SFN by western blot analysis.

2010/08/04 LabMeeting 心得彙整(自己Lab開)

小夏:報paper。E-cadherin localizes DDR1 to cell junctions, which may prevent its contact with collagen, and subsequently eliminates DDR1 activity and DDR1-suppressed cell spreading.

另外，補充 E-cadherin negatively regulates RTK activation的一篇paper，abrogation of E-cadherin regulation may contribute to the frequent ligand-dependent activation of RTK in tumors.

2010/10/27

1. The RNAs of TW02, TW03, TW04, TW05, TW06 are ready. The RNAs of HONE1 and TWO1 will be purified on next week.
2. EBV Rta can induce G1 arrest in TW01TetERTA #7, #16 and #19 in my 1st trial (19≧16＞7).
3. So far, to test the inhibition effect of U0126 in ERTA-induced EBV reactivation.

2010/11/03

1. EBV Rta induces growth arrest in the G1 phase of cell cycle in TW01TetER cell lines (the effect is #19＞#7).
2. Counting the viable cell by trypan blue exclusion method show that there is no difference between TW01TetER #7 and #19 in the growth rate for the period of 4 days.
3. Briefly introduce the NPC cell lines established from Dr. Chin-Tarng Lin and published in 1990 and 1993.

2010/11/17

報告這篇PAPER
1. LMP1 increases the release of EGFR into exosomes and that purified exosomes containing LMP1 and EGFR are taken up by epithelial, endothelial, and fibroblast cells, leading to the activation of ERK and PI3K/Akt pathways.
2. The ability to detect LMP1 in the exosome pellet harvested from serum of mice carrying the C15 tumor supports a physiological role of LMP1-containing exosomes in NPC.
3. EBV miRNAs have been detected in NPC exosomes.
4. The effects of EBV and LMP1 on exosomes are likely to be important factors in EBV infection through which a small number of cells expressing LMP1 could both modulate the tumor microenvironment and also potentially impact the infected host.

2011/02/16

1. To compare expression levels of various host proteins in TW01-EREV#27 with its parental cell TW01TetER#16.
2. Test p53 and CDK6 antibodies from ICON.

2011/03/02

No SFN signal in TW01TetEREV#27 cells may be due to GFP antibody-blocking. (Sorry didn’t think of it, I’ll check the probability)

2011/03/24

1. U0126 (MEK1/2 inhibitor) can inhibit EBV Rta induced p21 expression and EBV reactivation in EREV8.
2. caspase 3 is involved in the survival activity of DDR1 in OSCC (在OEC-M1 and TW2.6 中knockdown DDR1看到pro form的減少)。
3. 用autophage marker LC3B看看autophage是否參予著DDR1調控生長的機制。

2011/04/13

To test the effect of U0126 on EBV Rta-induced EBV reactivation on TW01EREV-2716
1. 初步結果72hr 20uM U0126死了一半的細胞 (WST-1 assay)
2. 感覺Dox 48小時活細胞有隨著U0126濃度的增加而增加
3. Dox 72小時細胞全部懸浮於medium，感覺72小時Dox作用效果遠大於U0126。(這樣可以說U0126是擋不住ER的Function? 也許可以像學姊早上說的降低Dox的量)
Next work will
1. Determine the cytotoxicity of U0126 on TW01EREV-2716 by WST-1 assay.
2. Confirm the expression kinetics (0-72hrs) of cell cycle regulators and viral proteins in Dox-treated TW01EREV-2716. (ex. SFN,p53)

2011/05/11

1. The expression kinetics (0-72 h) of cell cycle regulators and viral immediate-early proteins in Dox-treated TW01EREV-2716. (Rta, EAD, p53, SFN)
2. The cytotoxicity of U0126 on TW01EREV-2716: 72hr, IC50=45.76uM
3. Pretreat 20uM U0126 1hr before dox treatment can inhibit activation of MAPK (ERK 1/2), but don’t inhibit EBV reaction in 2716.
討論：
首先先釐清
1. Cell density與cell growth/senescence/death以及 viral reactivation有關
2. Dox conc.還可以降低嗎?
3. TW01TetER senescence的程度? (#16待做….)
3. 將以前做Rapa的實驗找出來看，綠染似乎有較淡，細胞數似乎有多一些，可以看看Rapamycin, LY其他抑制劑也許在Cell background不同的TW01上會有效。
4. 將MB教授的文章好好讀一讀。

2011/06/08

1. The long-term kinetics (0-6 days) of Rta in Dox-treated TW01TetER
2. The cytotoxicity of U0126, Rapamycin and LY294002 on TW01TetER
3. Effect of serum starvation on the cell morphology, cell number and cellular hypertrophy

2011/07/06

1. The long-term kinetics (0-6 days) of Rta in Dox-treated TW01TetER
The expression of p53, p21, SFN and p27 were increased in Rta induction. Increasing phosphorylation of H2AX was observed on day5 and day6 after Rta induction.
2. Compare the expression level of p21, SFN, c-Myc, p53 and p63 in Dox-treated TW01TetER and TW05TetER
The expression of p53, p21, and SFN were increased in Rta induction while the levels of c-Myc and p63 were decreased.
3. The cytotoxicity of U0126, Rapamycin and LY294002 on TW01TetER
IC50分別為：U0126 40uM, Rapamycin >10uM, LY294002 60uM
4. Test the effect of serum starvation and no glucose on the cell morphology in TW01TetER and TW05TetER
A. 在50000顆細胞的seeding下，serum starvation 48小時可以觀察到細胞生長停滯(也許是緩慢)。
B. 19號長得比16號快 (48小時內活細胞數會較16號多)，但19號也較16號快死(16號活細胞數較19號多)，我覺得19號代謝較快。
C. 不管是TW01或是TW05，細胞缺少葡萄糖最後會死亡(在第五天觀察)。而在缺乏葡萄糖48小時的情況下再添加葡萄糖回去，細胞可以回復正常生長。
D. Serum與Glucose對細胞的生長都很重要。

2011/08/10

1. 在TW01TetER及TW05TetER上Serum starvation的條件: 6-well種50000-100000 incubate 48h，serum free組與complete medium組相比，serum free組細胞數少，細胞長得細細長長，在細胞數與細胞型態上有差異性。
補充：根據之前flow data (call cycle analysis) 看48小時的實驗，細胞6-well種100000不至於過滿，200000細胞會過滿。所以我偏愛100000 incubate 48h的condition。接著模仿MB教授的實驗方法看看serum (glucose順道一起看)對Rta-induced cellular senescence.的重要性。(Ref）
2. Establishment of TW05-EREV：
結果：
(1) PEG濃縮病毒可以提高virus infection的效率（5%至20%, combine TGFbeta可達到30%），而TGFbeta則效果不彰。
(2) 細胞先放大至6-cm dish，再種1000顆細胞至10 cm dish進行G418 selection的過程中細胞便死光。
討論：
從12-well放大不要一下就放到6-cm dish中，建議先至6-well較適當。而G418 selection的步驟應該要在細胞放大時就做，防止沒有病毒的細胞勢力擴大。
若現在手邊的細胞已經沒有綠光的存在了，便重新開始以濃縮病毒的方式感染細胞。

2011/09/07

A. Whether serum is required for Rta-induced senescent phenotype in TW05tetER
1. 找出positive control沒有出來的原因。
2. 在一直serum free的情況下，dox-induction若有差別，才可以說明serum的重要性。
3. SA-beta-gal stain在9天有部分細胞是negative，像Escapee的細胞，也許時間要抓早一點來減少這些細胞的比率。
B. 接著先完成以下:
To figure out the expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cells
TW05TetER的doubling time，生長曲線。

2011/10/12

1. TW05TetER的doubling time為22.5hr，與TW05TetLuc差不多，繼續持續觀察。將計數long-time treatment的細胞數(mix well, to count 3 times)及WST-1 activity。
2. 設計TW05TetER做 “escape” 的實驗。
3. The expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cells
a. 在12-96hrs之間看不出kinetics，首先將找出Flag抗體的最佳條件，將Flag-ER壓出。
b. Dox induce 24hr之後wash off之後看12hr至72hr protein的degradation，結果Rta確實隨著時間degradate，但預設應該沒有變化的Luc72hr 卻也detect不到任何訊號，猜測也許是沒有加到dox(?)，將另一批sample lysis來確認這件事情。
4. Establishment of TW05EREV
目前有9株clones，1號細胞株先以Dox或TS induce 48hr以IFA看viral protein的分布比例; 及Q-PCR來偵測viral partical。IFA結果 Flag-Rta每一顆細胞都有，Q-PCR結果viral partical 偵測不到。未來screen clones看induction time 為72hr之後，先以Q-PCR來看viral partical是否有出來為主。

2011/12/07

1. 計數TW05TetER dox treat 1, 2, 3, 4天的細胞數(mix well, to count 3 times)及WST-1 activity沒有差異。建議一樣的條件只做LD與ED組別計數3天後的細胞數及測量WST-1 activity。
2. TW05TetER “escapee” 的實驗，設計失敗。
3. Flag抗體建議以Cell Signalling抗體來降低背景值，Rta的訊號(或雜band)用467抗體來證實。
4. 在TW05TetER，dox移除後，ER會隨著時間degrate，其程度與Luc相同，24小時已degrate超過一半; 若dox一直存在下，在96小時前ER的表現也都還會在。至於ER隨著時間增加而增加減少或者是持平，將會繼續釐清，將ER的Kinetics確定清楚。
5. TW05EREV的9株clones以Q-PCR來看viral partical的產生，#1, #4. #7有少量particle，#2, 3, 5, 6, 8, 9則沒有偵測到particle的產生。以WB來看#1, #4. #7 lytic protein的表現Zta: 7>1>4, gp350/220: 1, 7 >4; 隨著dox的induction, #1, #4, #7 的cellular protein p63皆下降，p53皆上升。

2012/02/01

1. 計數TW05TetLuc/ER dox treat 1, 2, 3, 5, 6, 8天的細胞數。
2. 以467確認Rta expression pattern 在TW01TetER及TW05TetER不同。 Rta expression level by WB: #19 ≧#16＞TW05TetER。將再確認p21, c-Myc, p53……的表現。
3. 準備HEK293, DOK, HSC3, SCC15, OECM1的genomic DNA來確認DDR1的mutation位點。
4.準備HEK293, DOK, HSC3, SCC15, OECM1的cDNA來確認DDR1的isoform。

2012/03/28

目前的工作: To determine the DDR1 mutations in 7 OSCC cell lines.
Note:
The external gene-specific primers and internal M13-appended PCR primers for activation loops and JM domain (Ref.1)(Ref.2) 這兩篇的mutation都與drug的sensitivity有關。

我稍微追了一下Ref.2: Cancer Cell 2005這篇以High-throughput DNA resequencing 在164 polycythemia vera病人當中的121位有 JAK2V617F missense mutation，其中41位homozygous mutation; 80位 heterozygous mutation。Homozygous mutations來自於mutation allele的duplication。這篇的貢獻在於Inhibition of the JAK2V617F kinase with a small molecule inhibitor leads to inhibition of proliferation of hematopoietic cells, suggesting that the JAK2 tyrosine kinase is a potential target for pharmacologic inhibition in patients with myeloproliferative disorders。

不過他們不是第一個在myeloproliferative disorders發現這個突變點的唯一group，幾乎在同時，另一個group也identify到JAK2V617F的 mutation 並且發表於Nature (2005)，這篇是在講 JAK2V617F mutation leads to constitutive tyrosine phosphorylation activity that promotes cytokine hypersensitivity and induces erythrocytosis in a mouse model。這兩篇是最早identify到JAK2V617F的group。

之後，一直到最近，這當中陸陸續續發表了好多篇針對JAK2V617F sensitive的kinase inhibitor的paper。如最近的(Blood. 2011) (Blood Rev. 2011) 這兩篇。很有趣耶(面白いね)。

2013/06/13

Slides have been uploaded to NAS.

2012/12/05

分享兩篇paper
1. 這篇: A model for ligand-induced DDR1 shedding.
(1) DDR1 在沒有collagen存在下，為全長125kDa的蛋白質。
(2) collagen刺激之下誘導DDR1 autophosphorylation，引起sheddase活化，進而將DDR1從細胞表面切成兩段(ectodomain shedding)。
(3) ectodomain shedding後，產生soluble DDR1 (a-subunit) 及membrane-anchored truncated DDR1 (beta-subunit) ，此時膜上的DDR1為tyrosine-phosphorylated 62kDa的蛋白質。

->因此猜測在OSCC細胞中Glivec處理之下，我們看到DDR1全長的增加的同時應該也可以看到62kDa DDR1的減少。

->對照我們的4株OSCC細胞在Glivec處理之下，62kDa DDR1在C9及OEC-M1中確實可以看到有下降的現象，撇開OC3來講，TW2.6仍需要再次確認這件事情。

2. 這篇: Discoidin domain receptor 1: isoform expression and potential functions in cirrhotic human liver.

肝硬化病人肝組織中全長的DDR1較正常人來得少，而shed DDR1 fragments較正常人多。

->已將cytosol改為soluble。

修改後的報告PPT檔案已放入NAS上。

2013/12/11

A. IP結果
1. AE316: 1) KR跟DNMT3b有很強的interaction; 2) ER/gZ跟三個DNMT都有interaction。
2. AE326: KR跟DNMT3b有interaction, ER沒有; ER與KR和DNMT3a都有interaction (雖然ER大於KR, 但KR本身的量也較少, 若補回來可能差不多)。
3. IP將Focus在DNMT3a與Flag-Luc, ER, KR間的Interaction情形。

B. To screen IFNG induced-IDO1 expression
1. 各個OSCC細胞間的IDO1表現應好好的跑在一起公平比較，在AE324中無法下定論。
2. AE324: IFNG can induce IDO1 expression in OSCC cells.
3. AE342: 參考Dr.洪明秀實驗室Wenchy的實驗方法，觀察OSCC在IFNG處理之下的細胞狀況(e.g., Cell rounding, Cell arrest, Cellular senescence, Cell death).

Date	Title
05/06/12	小夏: 確定DDR1 exon 9-17 PCR的條件，並且完成7株OSCC的定序(M13-Forward)。
05/06/12	小夏: 將7株OSCC exon9-17的定序結果比對，發現到7個mutation，其中有3個為silence mutation，當中有兩點為已發表之SNP。
05/06/12	小夏: 之後將進一步確定這些位點有可能參予的功能，做定點突變來探討這些mutation位點的function，又或許都為SNP。
05/23/12	小夏: There is no mutation in DDR1 exon15 and exon16 by reverse primer sequencing。
05/23/12	小夏: The mutations of S608L in OC3 and TW2.6 were double-checked by both forward and reverse primers。
05/23/12	小夏: Will continue to check exon11 mutation by reverse primer。
05/23/12	小夏: Amino acid 608 is located in the kinase domain。
05/30/12	小夏: There is no mutation in DDR1 exon11。
05/30/12	小夏: Only one missense mutation S608L is detected in exon9 to exon17。
05/30/12	小夏: Next is to determine whether S608L(C1823T) is an SNP polymorphism or not。
05/30/12	小夏: 前前後後送了150個sample送定序，回推這150個sample 需要pfu為14670元 (平均算100元/sample) + 酵素純化(67元/sample)+定序(100元/sample) =267; 其他試條件還有QLAGEN kit就沒有算進去了, 因此 exon/per cell 大概300元吧~
06/06/12	小夏: IFA of E-cadherin in OC3 and OECM-1 cells.
06/06/12	小夏: It seems that Glivec treatment in OECM-1 can down regulate E-cadherin expression at this trial.
06/06/12	小夏: However, there is no fluorescence in OC3 (low E-cadherin expression?)
06/06/12	小夏: Next will be to check (1) whether Glivec treatment can affect E-cadherin expression; (2) whether collagens can induce DDR1 expression.
06/27/12	小夏: IFA of Glivec-treated OECM-1
06/27/12	小夏: 繼續釐清Glivec是否影響到E-cadherin的表現與分佈情形。
07/04/12	小夏: Collagen I or IV can’t induce DDR1 expression in K2 and TW2.6 (just a little increase in TW2.6)
07/04/12	小夏: Glivec treatment can dramatically reduce E-cadherin in OEC-M1
07/11/12	小夏: To determine whether knockdown of DDR1 can affect E-cadherin expression in OSCC cells
07/11/12	小夏: Rhodamine-phalloidin staining of OC3 and OEC-M1(Trial 1)
07/11/12	小夏: The morphology of Glivec-treated OC3 and OEC-M1 cells
07/25/12	小夏: Rhodamine-phalloidin staining of OC3 and OEC-M1(Trial 2)
08/01/12	小夏: To validate whether collagens induce DDR1 expressions in OC3, TW2.6 cells and K2 cells.
08/01/12	小夏: To check the expression patterns of FGFR3 and pFRS2-a(Y196) in OSCC and T47-D cells.
08/08/12	小夏: Rhodamine-Phalloidin Staining of Glivec-treated TW2.6 and C9 cells.
08/01/12	小夏：Rhodamine-Phalloidin Staining of Glivec-treated TW2.6.
08/01/12	小夏：IFA of DDR1 in Glivec-treated TW2.6.
09/05/12	小夏：準備 fractionation實驗，來看DDR1在核、質、膜上之分布情況
09/05/12	小夏：IFA of DDR1，調整條件中。
09/26/12	小夏：The IFA condition for DDR1(C-20) is 1:500; will use this condition to confirm other OSCC cells
10/03/12	小夏：IFA assays of DDR1 localization in OSCC cells
10/31/12	小夏：DDR1在4株OSCC cells的IFA 除了C9有8-9成細胞nuclear-positive DDR1 satining以外,其他3株OSCC皆100% nuclear-positive DDR1 satining.
10/31/12	小夏：T47D則是nuclear-positive約4-5成，5-6成細胞是只有染在細胞膜與細胞質
10/31/12	小夏：Glivec treatment造成DDR1在細胞質點狀分佈的情況在C9及TW2.6明顯(>95%);OEC-M1次之;OC3沒有變化。
10/31/12	小夏：利用Subcellular fractionntion的實驗看DDR1在細胞質/細胞膜/細胞核中的分佈情況，目前在改善條件中。
11/07/12	小夏：Subcellular fractionntion的實驗進行中。
11/07/12	小夏：Harvest Glivec-treated OSCC lysate 。
11/14/12	小夏：Nuclear protein extraction of TW2.6 and T47D: 將再用PARP及Hostone H3來當nuclear protein marker
11/28/12	小夏：Subcellular fractionation的實驗結果顯示TW2.6細胞中DDR1主要位於細胞質，與TW2.6的IFA的結果吻合。
11/28/12	小夏：將進一步探討Gelivec是否會改變DDR1的分布。
11/28/12	小夏：找出p-Histone H3有效的抗體條件。
12/11/12	小夏：Subcellular fractionation of CGHNC9, OEC-M1 and SW780。
12/18/12	小夏：FGFR3-BAIAP2L1 fusion protein在SW780主要分布在細胞質。目前SW780培養條件在RPMI, 5%CO2。
01/24/13	小夏：Subcellular fractionation of TW2.6 and CGHNC9 cells。
01/30/13	小夏：To check apoptosis marker of Glivec-treated OSCC cells by Weatern blotting。
03/13/13	小夏：測試FGFR3抗體: Santa Cruz B9 is good, C15須重購。
03/27/13	小夏：C9細胞株中，處理AUY922藥物是否影響著DDR1的表現。
04/03/13	小夏：C9細胞處理AUY922( 0.1-1 uM, 48hr)的效果:抑制細胞的生長但不影響細胞死亡。
04/03/13	小夏：DDR1總量減少、分子量下降10-15 kDa; FGFR3的量反而增加 via Western blot analysis。
04/17/13	小夏：Cytotoxocity of cisplatin and 5-FU in OEC-M1 and TW2.6 cells.
04/24/13	小夏：Cytotoxicity assay of imatinib and dasatinib in K2 and K6 cells.
04/24/13	小夏：To determine wherther collagen-induced DDR1 activation sensitize the imatinib and dasatinib treatments in K2 cells.
12/25/13	小夏：IFNG induced cell death in OSCCs.
03/05/14	小夏：報告senescence相關資訊。

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