Sample ID:
A(Luc48)B(Luc24off24)
C(ER48) D(ER24off24)
E(KR48) F(KR24off24)
G(EV48) H(EV24off24)
I(KV48) J(KV24off24)
預計流程(可再議)
各細胞maintain者在星期五種三個十公分盤細胞在含藥培養其中,分別為Monday(2M),Tuesday(1.5M), Wednesday(1M)。
隔週週一,取Monday盤細胞,種兩個6孔盤(0.5M/well)培養在不含藥的tet-free medium中。週二加dox,週三取一盤6孔盤做wash-off步驟,週四收細胞(五格for RNA,一格for protein)。這是三個重複中的第一組。
三個重複中的第二組:週二取Tuesday盤細胞,種兩個6孔盤(0.5M/well)培養在不含藥的tet-free medium中。週三加dox,週四取一盤6孔盤做wash-off步驟,週五收細胞(五格for RNA,一格for protein)。
三個重複中的第三組:週三取Tuesday盤細胞,種兩個6孔盤(0.5M/well)培養在不含藥的tet-free medium中。週四加dox,週五取一盤6孔盤做wash-off步驟,週六收細胞(五格for RNA,一格for protein)。
哪 一組細胞送抽RNA做microarray呢?把30個protein sample先抽好做flag及p21測試,看induction及wash-off情形再定。因為要抽RNA,所以所有細胞harvest下來後均勻拍 散,全部先放進-80C冰箱待用。5M細胞約可抽出50ug RNA,而我們的需要量是3~5ug左右。
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2008/10/16 SFL wrote:
Purpose: To analyze transcriptome changes modulated by R.
Fact1: Treatment of TetER for 24h, remove dox, ER is depleted in 24h.
Fact2: Treatment of TetKR for 24h, remove dox, KR is depleted in 24h.
Fact3: Treatment of ERKV for 24h, remove dox, the expression of KbZIP is nearly indistinguishable from that in cells treated with dox for 72h, suggesting the amount of Flag-ER for KbZIP expression is only dependent on the first 24h of dox induction.
Fact4:十月底前需好晶片,十一月中會抵達,實驗操作至結果出來約一個星期搞定.晶片到達到開始做實驗不要超過三個月.
My design: 一組持續處理48h,一組處理24h後,wash-off inducer, incubate for another 24h
(1和2) Luc/d48 和 Luc/d24/off24
(3和4) ER/d48 和 ER/d24/off24
(5和6) KR/d48 和 KR/d24/off24
(7和8) EREV8/d48 和 EREV8/d24/off24
(9和10) ERKV/d48 和 ERKV/d24/off24
大 家請多多提供意見,謝謝。原則上1和2是3和4、5和6的對照組(同時對照leaky和dox)。3和4又可以作為7和8的對照組,而且7和8的 cDNAs還可以拿來做EBV genomic qRT-PCR。同理3和4可以作為9和10的對照組,而且9和10的cDNAs還可以拿來做KSHV genomic qRT-PCR。