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這是要上傳時的網頁,帳戶為sflin,密碼與實驗室中春夏秋電腦登入密碼同.新的作者投稿須知在此,或直接下載pdf檔.請各位作者有空時熟悉一下,謝謝.
Lab Meeting
量化西方墨漬法
以後實驗室quantitate protein band請依以下步驟進行: Plasmid 最好是一起抽的一批, 因實驗室LB/BHI已過使用期限,希望大家每次抽質體時盡量使用新鮮media及LB plate (1-cm厚度最佳),超過一個月以上的media及plate請自行定時清理(請不要當福壽螺到處蔓延留種,謝謝)。 若質體中有SV40-ori, 請以293T為host (DLR/expression etc),其餘它種質體則用293。 Transfection (24~48 h)每次請做p-100/1 ml-lysate的份量(6x p-35/1.2-ml), protein lysate量一次到位,不要老是重複在養細胞/TF效率好像有問題/plasmid不夠…(姑且稱之為小鼻子小眼睛的實驗) 檢測各質體間表現量:(i) 請以wild-type為標準 (所以wild-type可能要多transfect一份),293T為host的取5-ug及10-ug, 293為host的取25-ug及50-ug protein extracts run數片小膠,確定所使用的西方墨漬條件可分出一倍和兩倍間的差異。若是過強,那就請在砍primary/ secondary antibody濃度、incubation時間、ECL強度上三件事情上做調整。(ii)依前步驟所訂出的條件run一片小膠檢查各檢體間是否差異很大,如有二倍以上差異而各步驟又沒有太大疑慮,那表示可能有protein stability/proteosome involved,值得設計其他實驗來分析之.兩倍以下差異者微調input量可繼續往下的實驗。(Plasmid, 細胞用畢的請定時清理,不要當福壽螺到處蔓延留種,謝謝)。 附註定量software有三款,請在Lab Protocol中找到小抄。
清理完冰箱後…
首先要謝謝大家的通力合作,希望丟掉/收納一些東西後,大家的手氣會更順! 下週我會把新的list一一印出來,例如protein marker/DNA marker現在都只留一兩根在門上,其餘都已放進新的盒子中.在這段過度時間中,若有東西找不到,請不吝在版上留言.有任何建議或不暸解處,也請提出來討論.另外每天最後離開的人,請幫忙確定一下兩個-20是否都已上鎖!謝謝.
KSHV 2009
我們以後出國參加會議,尤其是歐美地區,所有步驟都要提早.才不會像這次一樣,慌慌張張地,處處都驚覺怎麼老是晚別人一部搶到好康的..目前SOP暫擬如下,請大家看看可行嗎?1)abstract在deadline前一週寫好,24~72小時前寄出.2)abstract deadline開始十天內是用來報名,詢問機票,旅館,籌劃旅程用的.3)出發日前六週填寫電子表單,以利行前取得補助款項 (ps.先付的註冊費用,應由老闆代墊).4)出發日前兩週完成Poster及Oral講稿,前一週完成rehersal（莫大的榮耀啊,恭喜小丸子…）5)出發日前三天:睡飽、寫完實驗記錄、培養輕鬆愉悅心情、期待學習之旅! 08/05/09 SFL wrote:旅館search result : 連結於此 (有眉目了呦,這次一定要把握, 大會秘書Leslie回信告知group rate確定已用完). 小丸子、Natsumi san我們今天來填電子表單怎麼樣?（十點左右我會下去先把旅館訂了,接著就來填表!）(ps有試著找尋下半年度在日本或香港適合各位的會議,結果=0 (殘念). 7/19/09 SFL wrote:將於九月十三~十六日在美國Charleston, South Carolina舉行.官方網站在這裡. 小嬿及小丸子可考慮競爭這個fellowship(註冊費475美金可waive掉). Due date for abstract submission is June-14.
Maxi-Prep Log
應是去年10月就該PO的-大力感謝小丸子及小嬿 ! (謝對人了嗎?)10/23/2008: (1)pEF1-RL, (2)pLenti-Flag-ERTA, (3)phRL-TK, (4) S634A/S636A10/29/2008: (1)pRp#5, (2) pLenti-Flag-KRTA11/21/2008: (1)pGL3-KRtapl, (2) pLenti4-Flag-CPOBHLF1-Luc (waiting..)
每天開工前請務必確認是否有已有AB number!
來問問大家的意見→為什麼不愛取AB number?這包括下列兩種情形:(A)有在寫實驗記錄,但累積至一定量才要去登錄;(B)只靠腦袋在記,並沒有在寫記錄。這是我們Lab必守規矩之一(正在操作中的實驗一定要有一個AB#),希望大家都能共襄盛舉! 每天不把目標確定好,就奮力地往前衝,形同沒有行程、沒有目的地的旅行,出差錯、顧此失彼、原地繞圈子的機率非常高。另外,好的遊記一定來自每分每秒的悸動與想法,要等都玩回來了才逐步去描述,許多感覺早已失真了。作為科學家,頭腦清楚,認真誠實地做記錄、寫報告是我們的本份。能把這項份內工作培養成興趣/習慣會更好。勉勵大家要盡忠職守,把實驗室LogBook當作是我們整體的成長寫真集,不要馬虎掉取AB#這個重要步驟。
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DLR 更新 (from 9/30/08 Lab Meeting 心得彙整)
小嬿的私房菜:1)ER對CMV-RL有50%抑制、對SV40-RL有66%抑制、對TK-RL有5倍活化能力,因此推薦EF1-RL為internal ctrl。2)gZ對SV40-RL有2倍活化、對TK-RL有4~5倍活化能力。3)KR對SV40-RL有80%抑制、對EF1-RL有異常高倍活化能力,因此推薦TK-RL或-hRL為internal ctrl。————————————–09/30/2008 Lab Meeting心得彙整Dual Luciferase assay: 所以,測試結果簡述如下.(1) Internal control: pFA-GAL4系列因KRTA/TA在40ng/well/24-well plate含有約1K~2K的內生性renilla luciferase活性,而vector control pFc-dbd當初卻沒有clone進去這段活性,所以最後選擇以值最高的pEF1-RL為internal control(約一萬)來蓋過KRTA/TA的basal level.(2)pLenti-Flag系列因pEF1-RL在不同activator:reporter比例被活化的程度不一, 所以選擇以variaion較少的pTK-RL或pTK-hRL為internal control.(3)以後操作DLR的SOP:第一步,找出哪個internal control不會被你的activator影響,這個數值代表的是你的每個well間transfection,passive lysis,到DLR assay這些步驟的一致性.當這個值高高低低(加減10%以上)的時候代表若非技術還待磨鍊,就是其它東西會影響這個internal control的表現量或活性,而這時候去思考firefly/renilla是…愚蠢的.第二步,activator/repressor對responsive elements常有bi-phasic mode,就是量在一個區域內是線性上升,可是在另一個高一點的區域內又會成線性壓抑(好像小富翁與大富翁對照快樂係數的比例,個人覺的一億台幣是那個分界點…ㄟ怎麼會談到這個?)所以像這次Maruko和YCK做的不同比例測試的前置實驗是需要的.Maruko:全長KR之DLR以TK-RL或TK-hRL作為internal control均可(ps.SV40-RL會被KR抑制80%活性,而EF1-RL似乎被瘋狂活化);IP進行中;latency disruption籌劃中.小嬿:(1)之前結果顯示EBV Z對SV40 promoter會有二倍活化,對TK-RL(or)TK-hRL有4~5倍活化.(2)以SV40-RL為internal control下,證實gZ,cZ可活化BHLF1-Luc,tZ is non-functional.(3)以electroporation方法證實gZ,cZ可活化p3HR1中EAD,但是endogenous Z好像沒出來(a梗?). (4)293Tet_gZ(3 clones), 293Tet_cZ(2 clones), and 293Tet_tZ持續放大篩選中.(5)下星期被吩咐要報RNA pol II pausing的paper所以(實驗進度就免了).建議實驗:(1)EBV Rta與Zta的transient-transfection實驗,仿小丸子和YCK上週做的2:1, 1:1, 1:5, 1:11條件,看看EBV Rta與Zta對其direct-binding promoter之behaviour是否相似?(2)P3HR1那一組blots,雖亂,考慮檢查endogenous Rta是否有被叫出?(用NTU ascites那一管)Ingrid:Protein purification進行中;DLR western blot analysis 進行中;pFA-GAL4活性測試條件決定,其中366AA絲毫不差地repeat了PWW結果,366EE亦上升,暗示OGlcNAc修飾會壓低TA活性.另外,全長,各clone表現量與latency
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實驗室工作分配 (定稿)
小丸子:OrionL、PCR儀器前公用區域、細胞間、咨詢。Ingrid:管帳、庫存採買、CO2/LqN2、化安、團購、同事間感情維繫。小蓮:生安、lightbox前公用區域、協助管帳及庫存採買。小嬿:藥品間、protein bench、new idea引進、發問。以上分配是可以喬的,若覺得太多或沒有分配到你的天生強項,請務必留言告知。買東西方面還是跟往常一樣,多問、多想。購買時的登錄、貨到達時的簽收、datasheet歸檔等好習慣,大家要繼續保持。 各區域負責人有任何”規矩”希望大家遵守的,請隨時提出來,謝謝。