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製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop(4) pGEXHis_BALF3(1)的代製抗體已收集，經由細胞lysate測試，證實可以辨認EBV Zta，但akata strain的Zta 的mobility(略低)與細菌表現的不同，接下來要釐清抗體是否有純化，且可否應用於IFA或IP。 (也要釐清是否會辨認B95.8 strain的Zta)(2)(3)(4)在BL21、DH5α及Rosetta-gami2中，經過調整表達條件，目標蛋白質皆不明顯增多。

製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體 (全部已clone成功)(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop(4) pGEXHis_BALF3(2)(3)(4)除pGEXHis_ER_L550stop尚未表現，其餘在BL21表達蛋白質皆不明顯增多，且皆比預測值大約6-8kDa。目前採取的策略如下(1) 使用未開封的LB/BHI或跟其他實驗室要一點LB來做control(2) 表現蛋白質時，Amp濃度提高至200ug/ml，IPTG濃度降至0.1或0.5mM，加IPTG前應養約3-5小時直到OD600=0.6，同時使用DH5α作表現。(3) 做BL21及DH5α的competent cell林同學的論文中提及她用的ER1-320中(Dr. Miller提供，疑是B95-8 strain)很多Arg皆已被突變掉，包括Arg83、86、88、89及90，在我們MABA strain，這些位置皆是Arg。另外根據PWW的紀錄，二者的核酸序列有10個不同處，但只有2個amino acid不同。

1. 在ERKV細胞中，將shLUC、shOGT及shMGEA5 lentivirus分別送入，再經由Dox treatment使KSHV進入lytic reactivation，收集medium並用Q-PCR測量產生的KSHV copy number，結果依序為shLUC＜shOGT＜shMGEA5。 2. 製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體(1) pGExHis_KR_Q658stop and pGExHis_cZ :KRQ658表現蛋白量很少，以至於無法正確判斷是哪一條band，故重新表現蛋白質並以His Ab確認，同時確認質體是否錯誤(原template: GEx-2T-GST_KRQ658)；Zta蛋白質表現量極佳，已送出代製抗體。PS理論上，Zta為270aa約為30kDa，但在SDS-PAGE gel上的band為38kDa，多出8kDa?(2) pGExHis_ER_Q320stop and pGExHis_ER_L550stop(3) pGExHis_KR_E600stop and pGExHis_BALF3

報告Thorley-Lawson DA.在上個月的PLoS Pathogens發表的paperA Novel Persistence Associated EBV miRNA Expression Profile Is Disrupted in Neoplasia.作者利用primary normal infectious tissues : LCL, NCB, MemB及tumor biopsies : HD, NPC, GaCa, BL進行34種EBV miRNA分析。將12種BART miRNAs命名為latency III associated miRNAs。而這些miRNA在分類為latency I (BL) 及latency II (HD, NPC, GaCa) 腫瘤組織中皆失去控制而表現量增加；相對於另一群EBV miRNAs，則BHRF1 miRNAs (大部分皆表現在latency III的LCL) 則並未失去控制而表現量很低。接著以heat-map/clustering或principal component analysis進行資料分析，發現並沒有tumor-specific miRNA，但综合所有數據，的確可以將不同腫瘤分類，類似於電腦界及物理界的”secret sharing”定律，舉例說明，在約40種miRNAs中，任選5個miRNA就足以將腫瘤分類成功的機率約為60%。最後以細胞株進行分析，發現若以研究miRNA而言，這些腫瘤細胞的表現形式已與他們的來源腫瘤組織不同。

(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；經更改IP流程，可以有效率以KR(660) from ICON將KR抓下(ERKV_Dox48h)，但是之後應用於ERKV_shLuc_Dox48h、ERKV_shOGTA1_Dox48h及ERKV_shMGEA5B2_Dox48h，卻效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。目前持續改進IP流程中。Note:如果是要看KR蛋白質，建議Lysis buffer要加phosphotase inhibitor以避免KR的碎裂。 (2) 關於進行shRNA的Q-PCR，已完成實驗數據。但是分析時，應注意星號的標誌，正確為*p

(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；結果是可以成功以KR(660) from ICON將KR抓下，但是效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。接下來會以重收細胞(以EBC Buffer溶解細胞)、增加cell lysate或KR(660)的量來改進IP效率。NOTE：以6% SDS-PAGE分析；KR(Ueda)會認到2條band? (2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。結果發現ACTIN primer會影響，但GAPDH不會影響。經重複實驗，排除off-target作用。(3) TW01TetLuc有4株clones及TW05TetLuc有4株clones進行WB (Flag Ab) 確認為positive。接著進行計數細胞，將生長速率差不多的細胞混合。NOTE：Flag Ab是否有問題?

(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6×10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收細胞計數螢光比例(第4次實驗)。發現綠螢光的細胞佔全部細胞約80-85%；紅螢光的細胞佔綠螢光細胞約30%(Dox)、5-10%(NC)、30%(shLuc)、40-50%(shOGT-A1)及65-70%(shMGEA5-B2)。收lysates進行WB確認。且用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度。 (2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。由於結果無法排除off-target作用，進行或重複實驗以確認。(3) TW01TetLuc有2株clones及TW05TetLuc有8株clones進行IFA (Flag Ab) 確認。由於背景值太高，無法確定是否有Luc蛋白質表現，故進行WB以確認。

(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6×10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，發現shOGT-A1及shMGEA5-B2皆比shLuc引起更多的lytic reactivation。且送入shOGT的細胞樣本中，除了OGT蛋白質減少，MGEA5蛋白質也減少，送入shMGEA5的細胞樣本中，除了MGEA5蛋白質減少，OGT蛋白質也減少。重複之前收集的2次實驗樣本，也得到一樣的結果。進行Q-PCR檢查送入shOGT的細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，避免shRNA有認錯目標的效用。且用IP將KR抓下，用WB來確認O-GlcNAc變化程度。 (2) 將TW05TetER的＃7+9+10+12 (Flag Positive ratio=87~-96％) pool成一個clone。(3) 重新建立TW01TetLuc及TW05TetLuc，目前正在用Zeocin篩選clones。(4) TW05TetER/gZ有28clones進行WB篩選，Rta alone、gZ alone和Rta+gZ皆有篩出，接下來進行IFA確認。