DATO

關於CRISPR sgRNA的設計跟構築 除了委託廠商代工外 現在常用的方法 是利用外切 restriction enzyme去製造linear plasmid 再利用合成stick end 互補股引子的方式去 ligation 常用的restriction enzyme會是類似BbsI這類特別的酵素 因為他們的切點在辨識序列的外側 (5′ or 3′)來行成stick end 所以只要在合成primer的時後先預留正確的extra base 將回溶/reannealing/PNK 處理過的片段作ligation 就能得到sgRNA vector， 要在經定序後確認，即可得到sgRNA。 目前sgRNA的確認只能用定序的，因為塞入的片段太小(23bp)， 加上sgRNA設計的時候沒有在原始被移除的序列中加上vector其他部位已經有的切位 所以需要這部，或是可以在製造linear vector的時後check 不會有 uncut vector存在 addgene提供的 空sgRNA vector 多數是用這個方法(Humanized sgRNA是例外，我被暗算過)empty sgRNAhttp://www.addgene.org/crispr/empty-grna-vectors/ 裡面也有提供類似冷泉港的單一vector。 利用這個方式建構的sgRNA成本會遠低於委託廠商代工 主要花的錢包含vector購買(NT 3000)/ primer 合成 (~50 bp per clone)/ PNK 跟 restriction enzyme  (各約莫三千元左右，可多次使用) 以下在附上我常用的sgRNA設計網站sgRNA […]

Paper:http://genomebiology.com/content/pdf/gb-2006-7-10-r100.pdf 軟體下載網頁:http://www.cellprofiler.org/ 這也是BROAD Institute 出的一個軟體 應該可以取代AIS 來計算invasion 細胞數目 甚至可以提供更多功能 只是 目前我自己沒有要用到的地方 就沒有鑽研了!

Database of Gene transcription in mouse embryo http://www.eurexpress.org/ee/intro.html 上面的資料庫是利用In situ hybirdization 來偵測特定基因/ microRNA 在老鼠胚胎中的表現強度與位置 可以用來尋找有興趣的基因 在老鼠發育的過程中是否有扮演角色

我是大頭 插花在一堆小字輩的中間 哈哈 BTW 黃憲達要來演講耶!!  1.  Time ：  13:30 ~ 15:00 (Tue) 20 March 2012  Topic：  MicroRNA Resources for Biomedical Science : Databases  and Tools  Speaker：  Hsien-Da Huang (黃憲達), PhD