小嬿

Progress Report 1. 欲觀察CTCF是否在EBV/KSHV的潛伏期中扮演repressor的角色:a) 利用shRNA-lentivirus infection方式knockdown CTCF expression五天之後, 發現病毒RNA/protein表現量上升, 存在於細胞中及release到上清液的的病毒DNA copies也變多. –> shCTCF clone B情況較特殊, 將mix其他三個clone的病毒液再觀察一次結果 –> viral transcripts/protein可多看BMRF1, K-bZIPb) 將CTCF表現質體送入細胞中表現3天, 發現病毒RNA/protein表現量沒有變化, 存在於細胞中及release到上清液的病毒DNA copies變化也不大 –> 調整細胞濃度做DNA transfection再觀察一次 2. 利用ChIP方式觀察EBV Rta表現是否影響CTCF結合於病毒基因體的能力. 初步結果可觀察到Dox-48hr細胞中, CTCF binding量比non-induction少; 而Rta除了binding在已知的RRE之外, 在目前所偵測的DNA片段上也都有Rta的訊號. –> EREV8的ChIP訊號都比ERKV弱, 需要多加確認 –> ChIP所得DNA量太少, 將做些調整以提高所得DNA濃度

Progress report:1. 欲確定在293TetLuc細胞中, Dox treatment 3-9hrs之間, CTCF結合在c-Myc/H19 promoter的pattern. 初步CTCF-ChIP assay結果顯示在兩個promoter上, CTCF的結合量未有明顯的改變. 之後將進行293TetER細胞的CTCF-ChIP assay. 2. 分析目前已知Rta會結合的promoters, 利用軟體預測Rta responsive element(RRE)/CTCF binding site(CBS)/sp1 binding site. 目前觀察到的情形如下:a) CTCF 與Rta結合位置重疊: BALF2, SFNb) CTCF 與Sp1結合位置重疊: p21, SFNc) CTCF/Rta/Sp1結合位置是鄰居: BLLF3, BHRF1/BHLF1分析結果未整理完全, 待續 3. 利用direct infection的方式建立攜帶螢光的293LucEV/293EREV. 所篩到的clone能被Dox induction出來的viral particles比EREV8少了至少10倍. 之後提高G418濃度也未能讓viral particles被release更多, 因此先停住這個實驗.  

進度報告 1. 為避免viral genome的干擾, 將系統換回TW01TetLuc及TW01TetER_16. 比較Dox處理6, 24, 48小時, CTCF binding在H19 ICR及c-Myc P2 promoter位置的量. Q-PCR結果顯示在兩個細胞中24小時CTCF結合在H19 ICR量比6小時多,並且在48小時下降; 在P2 promoter的位置, Luc細胞在三個時間點的結合量相近, ER細胞在24小時結合量上升, 48小時下降. 但, 兩組CTCF結合位置在Luc組細胞都比ER組來得多 –>加做Ctrl-6hr觀察Luc/ER兩組細胞的background差異 2. 整理過去paper報導CTCF在EBV/KSHV genome上的binding sites(CBS) –> EBV genome上約有20個位點, KSHV約有10個位點, 兩者的胃點有些有相似 –> 先focus在LCR, K-RTA/BZLF1 promoter, 及OriLyt等位置, 準備設計primers

進度報告: 1. 確定ChIP的前置步驟條件:Cell: 4 x 10^7 cells/ml lysis bufferSonication: 45″ ON, 45″ OFF for 10-12 cycles (depend on cell type)2. 在TW01-EREV_2716細胞中, 觀察到CTCF在Dox處理24小時後結合在cellular promoters上的量比6hrs與未處理Dox的細胞來得多. 顯示 Rta的出現可能讓CTCF對這些promoter的affinity更好. 但是在EREV8細胞中, 同樣的時間點沒辦法看到類似的情況. –> 補齊其他cellular promoter的PCR detection.–> 目前推測TW01EREV-2716走lytic cycle的速度比EREV8來得快, 可能24hr還看不到CTCF在EREV8細胞的變化. 試試在EREV8細胞中觀察48小時的CTCF ChIP.

學姐, 教師節快樂!! 進度報告:1. 利用Chromatin IP的sample做IP-WB測試CTCF/Flag/Rta抗體使用量:(1) CTCF使用cell signaling的rabbit Ab(12 ul)效果較佳(2) Flag使用cell signaling的rabbit Ab(12 ul)效果較佳, 但抗體未完全bind在磁珠上, 可再降低抗體量(3) Rta抗體(Argene)黏附於磁珠的效果不佳, 所抓到的Rta量也不多–> 確定sonication條件之後就可以上述兩個較好的抗體做ChIP! 2. 測試Akata-EGFP/EBV產出的病毒infect HEK293細胞的效率(1) 以IgG-48hrs的效果最好, 但所看到GFP(+)的細胞大部分都不健康–>調整病毒濃縮的倍數, 看看是不是病毒太多, 或PEG太多讓細胞有毒性(2) 將infect 48hrs的細胞收下測得微弱的Rta跟size較小的Zta–> Z若未經modification應為29kDa, 用western看到Akata strain的Z約38kDa, 比B95.8大(約36kDa); 而truncated form最小, 約31kDa(推算); 之後可收RNA, 看所測到的Z是否有truncation.

1. 修正sonication條件為30″ ON, 30″ OFF, 8 cycles, 利用此條件在TW01TetER_16細胞做ChIP. 初步測試myc primer, PCR條件未達到最好: 1) 跑膠結果有很多用剩的primer或dimer; 2) input量很多, 而IP的量很少, 沒有調整好比例; 3) myc-2和myc-3的product跑2% agarose不漂亮–>end-point PCR 固定template量, 調整input的跑膠量; myc-2 myc-3跑3% agarose gel–>試試Q-PCR條件 2. 利用Thermo fractionation kit分出TW01TetER_16細胞的nuclear extract做IP, WB結果看到CTCF有抓到疑似Rta的band, 但用Flag抗體IP則看不到CTCF.–>將Flag-Luc, ER, KR, gZ送入HEK293細胞中表現24 hrs後收lysate做IP, WB結果看到CTCF可抓到明顯的ER(by 467)和微弱的gZ(by 4F10), 抓不到Luc(by Flag)和KR(by Yoshi’s Ab); 但用Flag IP, 則在四組細胞中都沒有看到CTCF.