小夏

目前的工作: To determine the DDR1 mutations in 7 OSCC cell lines. Note:The external gene-specific primers and internal M13-appended PCR primers for activation loops and JM domain (Ref.1)(Ref.2) 這兩篇的mutation都與drug的sensitivity有關。 我稍微追了一下Ref.2: Cancer Cell 2005這篇以High-throughput DNA resequencing 在164 polycythemia vera病人當中的121位有 JAK2V617F missense mutation，其中41位homozygous mutation; 80位 heterozygous mutation。Homozygous mutations來自於mutation allele的duplication。這篇的貢獻在於Inhibition of the JAK2V617F kinase with a small molecule inhibitor

1. 計數TW05TetLuc/ER dox treat 1, 2, 3, 5, 6, 8天的細胞數。2. 以467確認Rta expression pattern 在TW01TetER及TW05TetER不同。 Rta expression level by WB: #19 ≧#16＞TW05TetER。 將再確認p21, c-Myc, p53……的表現。3. 準備HEK293, DOK, HSC3, SCC15, OECM1的genomic DNA來確認DDR1的mutation位點。4.準備HEK293, DOK, HSC3, SCC15, OECM1的cDNA來確認DDR1的isoform。

1. 計數TW05TetER dox treat 1, 2, 3, 4天的細胞數(mix well, to count 3 times)及WST-1 activity沒有差異。建議一樣的條件只做LD與ED組別計數3天後的細胞數及測量WST-1 activity。2. TW05TetER “escapee” 的實驗，設計失敗。3. Flag抗體建議以Cell Signalling抗體來降低背景值，Rta的訊號(或雜band)用467抗體來證實。4.在TW05TetER，dox移除後，ER會隨著時間degrate，其程度與Luc相同，24小時已degrate超過一半; 若dox一直存在下，在96小時前ER的表現也都還會在。至於ER隨著時間增加而增加減少或者是持平，將會繼續釐清，將ER的Kinetics確定清楚。5. TW05EREV的9株clones以Q-PCR來看viral partical的產生，#1, #4. #7有少量particle，#2, 3, 5, 6, 8, 9則沒有偵測到particle的產生。以WB來看#1, #4. #7 lytic protein的表現Zta: 7>1>4, gp350/220: 1, 7 >4; 隨著dox的induction, #1, #4, #7 的cellular protein p63皆下降，p53皆上升。

1. TW05TetER的doubling time為22.5hr，與TW05TetLuc差不多，繼續持續觀察。將計數long-time treatment的細胞數(mix well, to count 3 times)及WST-1 activity。2. 設計TW05TetER做 “escape” 的實驗。3. The expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cellsa. 在12-96hrs之間看不出kinetics，首先將找出Flag抗體的最佳條件，將Flag-ER壓出。b. Dox induce 24hr之後wash off之後看12hr至72hr protein的degradation，結果Rta確實隨著時間degradate，但預設應該沒有變化的Luc72hr 卻也detect不到任何訊號，猜測也許是沒有加到dox(?)，將另一批sample lysis來確認這件事情。4. Establishment of TW05EREV目前有9株clones，1號細胞株先以Dox或TS induce 48hr以IFA看viral protein的分布比例; 及Q-PCR來偵測viral partical。IFA結果 Flag-Rta每一顆細胞都有，Q-PCR結果viral partical 偵測不到。未來screen clones看induction time 為72hr之後，先以Q-PCR來看viral partical是否有出來為主。

A. Whether serum is required for Rta-induced senescent phenotype in TW05tetER1. 找出positive control沒有出來的原因。2. 在一直serum free的情況下，dox-induction若有差別，才可以說明serum的重要性。3. SA-beta-gal stain在9天有部分細胞是negative，像Escapee的細胞，也許時間要抓早一點來減少這些細胞的比率。B. 接著先完成以下:To figure out the expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cellsTW05TetER的doubling time，生長曲線。

1. 在TW01TetER及TW05TetER上Serum starvation的條件: 6-well種50000-100000 incubate 48h，serum free組與complete medium組相比，serum free組細胞數少，細胞長得細細長長，在細胞數與細胞型態上有差異性。 補充：根據之前flow data (call cycle analysis) 看48小時的實驗，細胞6-well種100000不至於過滿，200000細胞會過滿。所以我偏愛100000 incubate 48h的condition。接著模仿MB教授的實驗方法看看serum (glucose順道一起看)對Rta-induced cellular senescence.的重要性。(Ref） 2. Establishment of TW05-EREV： 結果： (1) PEG濃縮病毒可以提高virus infection的效率（5%至20%, combine TGFbeta可達到30%），而TGFbeta則效果不彰。 (2) 細胞先放大至6-cm dish，再種1000顆細胞至10 cm dish進行G418 selection的過程中細胞便死光。 討論： 從12-well放大不要一下就放到6-cm dish中，建議先至6-well較適當。而G418 selection的步驟應該要在細胞放大時就做，防止沒有病毒的細胞勢力擴大。 若現在手邊的細胞已經沒有綠光的存在了，便重新開始以濃縮病毒的方式感染細胞。