08/10 Lab Meeting- 小夏

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1. 在TW01TetER及TW05TetER上Serum starvation的條件: 6-well種50000-100000 incubate 48h，serum free組與complete medium組相比，serum free組細胞數少，細胞長得細細長長，在細胞數與細胞型態上有差異性。 補充：根據之前flow data (call cycle analysis) 看48小時的實驗，細胞6-well種100000不至於過滿，200000細胞會過滿。所以我偏愛100000 incubate 48h的condition。接著模仿MB教授的實驗方法看看serum (glucose順道一起看)對Rta-induced cellular senescence.的重要性。(Ref） 2. Establishment of TW05-EREV： 結果： (1) PEG濃縮病毒可以提高virus infection的效率（5%至20%, combine TGFbeta可達到30%），而TGFbeta則效果不彰。 (2) 細胞先放大至6-cm dish，再種1000顆細胞至10 cm dish進行G418 selection的過程中細胞便死光。 討論： 從12-well放大不要一下就放到6-cm dish中，建議先至6-well較適當。而G418 selection的步驟應該要在細胞放大時就做，防止沒有病毒的細胞勢力擴大。 若現在手邊的細胞已經沒有綠光的存在了，便重新開始以濃縮病毒的方式感染細胞。

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NP460hTERT in KGM2

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由 sufang 在 三, 08/10/2011 – 14:54 發表 Older Posts EBV infection EBV Rta NP460hTERT transient lytic 2011/08/10 Lab Meeting 1. The trial of new medium KGM-2 ── comparing with medium DKSFM/EpiLife for culturing NP460hTert: (1) Cells culturing in KGM-2 showed more like triangle shape rather than elongated morphology as seeding in DKSFM/EpiLife. (2) Cells

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08/03 Lab Meeting-小嬿

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進度報告1. 在HEK293分別做Flag-Luc/ER/KR/gZ的transient transfection 24hrs,a. IP CTCF: 1/6 of IP中, WB CTCF未有band–>用5/6的memebrane check again;5/6 of IP中看到ER (by 467), 微弱的gZ(by 4F10), 未見KR(by Yoshi’s);b. IP Flag: 失敗! 1/20 of IP可見Flag蛋白被IP下來, 但未見CTCF!@WHT建議二抗濃度可再做調整, 讓background更乾淨(e.g. ~100 kD的band)@在TW01系統試試看!@SFL建議在293FT做transfection效果更佳! (plus co-co-co-transfection!)2. 利用ChIP分析TW01TetER_16細胞中, 在Dox induction的狀況下, CTCF所binding的DNA fragment量是否有所改變–>依據Q-PCR結果顯示, input DNA量不穩定, 影響CTCF IP的數值計算; mock(IgG) IP所得DNA量較少, Ct值SD非常大@SFL建議做少一點sample量, IP CTCF和Rta, 並且screen先前擬定偵測的gene GOGOGO! 往PLoS Pathogen邁進!!!

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0720 Lab meeting-蔡小丸

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1. 在293FT細胞中共同表達K-RTA, S634A/S636A, Luc (control protein)及Pin1, 結果發現Pin1降解K-RTA及S634A/S636A的能力相似2. 用一批新抽的K-RTA及S634A/S636A transfection至293FT後發現, K-RTA與S634A/S636A穩定性接近, 推測634/636位點磷酸化與否與其穩定性無關3. 完成oral cancer tissue microarray (BC34011, HN811)之DDR1 IHC染色, 未來將進行DDR1表達量之給分4. 整理DDR1之ligans-collagens(type1-5)在一些oral cancer tissues中觀察到他們的RNA level有增加的情形, 最後我們認為在口腔癌中, collagen type1及type4為可能較重要的DDR1 ligands

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7/13 Lab Meeting-ingrid

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(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；結果是可以成功以KR(660) from ICON將KR抓下，但是效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。接下來會以重收細胞(以EBC Buffer溶解細胞)、增加cell lysate或KR(660)的量來改進IP效率。NOTE：以6% SDS-PAGE分析；KR(Ueda)會認到2條band? (2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。結果發現ACTIN primer會影響，但GAPDH不會影響。經重複實驗，排除off-target作用。(3) TW01TetLuc有4株clones及TW05TetLuc有4株clones進行WB (Flag Ab) 確認為positive。接著進行計數細胞，將生長速率差不多的細胞混合。NOTE：Flag Ab是否有問題?

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EBV Rta-induce cellular senescence in nasopharyngeal cells

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小嬿: (A) 搞定EBV Rta 對 CTCF 在 genome organization 之影響。 (B) 行有餘力 (and a hobby!): Establishment of TW05-EREV Jean: (A) Find out the best differentiation protocol for NP460hTert. (1) reagents: TGFb, calcium … (2) markers: p63, MYC… (3) controls: TW05TetER and TW01TetER #16 cells (4) Ref: 第一篇，第二篇 , 第三篇… (B) 行有餘力: Cloning of TW05-EREV (由小嬿、小夏指導)小夏:Continue

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07/06 Lab Meeting- 小夏

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1. The long-term kinetics (0-6 days) of Rta in Dox-treated TW01TetER The expression of p53, p21, SFN and p27 were increased in Rta induction. Increasing phosphorylation of H2AX was observed on day5 and day6 after Rta induction.2. Compare the expression level of p21, SFN, c-Myc, p53 and p63 in Dox-treated TW01TetER and TW05TetERThe expression of

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06/29 Lab Meeting-小嬿

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1. 修正sonication條件為30″ ON, 30″ OFF, 8 cycles, 利用此條件在TW01TetER_16細胞做ChIP. 初步測試myc primer, PCR條件未達到最好: 1) 跑膠結果有很多用剩的primer或dimer; 2) input量很多, 而IP的量很少, 沒有調整好比例; 3) myc-2和myc-3的product跑2% agarose不漂亮–>end-point PCR 固定template量, 調整input的跑膠量; myc-2 myc-3跑3% agarose gel–>試試Q-PCR條件 2. 利用Thermo fractionation kit分出TW01TetER_16細胞的nuclear extract做IP, WB結果看到CTCF有抓到疑似Rta的band, 但用Flag抗體IP則看不到CTCF.–>將Flag-Luc, ER, KR, gZ送入HEK293細胞中表現24 hrs後收lysate做IP, WB結果看到CTCF可抓到明顯的ER(by 467)和微弱的gZ(by 4F10), 抓不到Luc(by Flag)和KR(by Yoshi’s Ab); 但用Flag IP, 則在四組細胞中都沒有看到CTCF.

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To ship RNA sample without dry ice

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2011/06/28 To ship RNA sample without dry ice由 sufang 在 二, 06/28/2011 – 10:19 發表 Older Posts RNA-seq shipping RNA samples This is an old post from sophia at 仲彥老師’s lab (sophia).  2011-06-28There is a new way to preserve samples. In room temperature, not deep freeze in -80C. http://www.biomatrica.com/rnastable_products.php (not working)try this one : tinyurl.com/yasox9n2 The

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