09/28 Lab Meeting-小嬿

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學姐, 教師節快樂!! 進度報告:1. 利用Chromatin IP的sample做IP-WB測試CTCF/Flag/Rta抗體使用量:(1) CTCF使用cell signaling的rabbit Ab(12 ul)效果較佳(2) Flag使用cell signaling的rabbit Ab(12 ul)效果較佳, 但抗體未完全bind在磁珠上, 可再降低抗體量(3) Rta抗體(Argene)黏附於磁珠的效果不佳, 所抓到的Rta量也不多–> 確定sonication條件之後就可以上述兩個較好的抗體做ChIP! 2. 測試Akata-EGFP/EBV產出的病毒infect HEK293細胞的效率(1) 以IgG-48hrs的效果最好, 但所看到GFP(+)的細胞大部分都不健康–>調整病毒濃縮的倍數, 看看是不是病毒太多, 或PEG太多讓細胞有毒性(2) 將infect 48hrs的細胞收下測得微弱的Rta跟size較小的Zta–> Z若未經modification應為29kDa, 用western看到Akata strain的Z約38kDa, 比B95.8大(約36kDa); 而truncated form最小, 約31kDa(推算); 之後可收RNA, 看所測到的Z是否有truncation.

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9/21 Lab Meeting-ingrid

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報告Thorley-Lawson DA.在上個月的PLoS Pathogens發表的paperA Novel Persistence Associated EBV miRNA Expression Profile Is Disrupted in Neoplasia.作者利用primary normal infectious tissues : LCL, NCB, MemB及tumor biopsies : HD, NPC, GaCa, BL進行34種EBV miRNA分析。將12種BART miRNAs命名為latency III associated miRNAs。而這些miRNA在分類為latency I (BL) 及latency II (HD, NPC, GaCa) 腫瘤組織中皆失去控制而表現量增加；相對於另一群EBV miRNAs，則BHRF1 miRNAs (大部分皆表現在latency III的LCL) 則並未失去控制而表現量很低。接著以heat-map/clustering或principal component analysis進行資料分析，發現並沒有tumor-specific miRNA，但综合所有數據，的確可以將不同腫瘤分類，類似於電腦界及物理界的”secret sharing”定律，舉例說明，在約40種miRNAs中，任選5個miRNA就足以將腫瘤分類成功的機率約為60%。最後以細胞株進行分析，發現若以研究miRNA而言，這些腫瘤細胞的表現形式已與他們的來源腫瘤組織不同。

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0914 Lab meeting-蔡小丸

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1. 著手進行三張tissue microarray的DDR1 staining給分(1) 依顏色深淺給予: 0-3分(2) 依tumor所佔區域大小給分: 0-3分(3) 分部位分開計分 (已完成舌頭, 臉頰)仍需解決的問題是 tumor part的判別~~需要請教別人 並且再多看一些slide 累積經驗希望早日完成計分 並進行統計分析2. 學姊建議整理DDR1相關data, 以利之後的方向

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09/07 Lab Meeting- 小夏

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A. Whether serum is required for Rta-induced senescent phenotype in TW05tetER1. 找出positive control沒有出來的原因。2. 在一直serum free的情況下，dox-induction若有差別，才可以說明serum的重要性。3. SA-beta-gal stain在9天有部分細胞是negative，像Escapee的細胞，也許時間要抓早一點來減少這些細胞的比率。B. 接著先完成以下:To figure out the expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cellsTW05TetER的doubling time，生長曲線。

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08/31 Lab meeing-小嬿

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1. to observe whether CTCF interact with EBV Rta by Immunoprecipitation assay a) in TW01 inducible cell lines, CTCF and Flag-Rta can not be immunoprecipitated by each other. I also tried Flag beads, which are provided by Sigma, both of Flag-Luc and Flag-ER caught CTCF. I can not prove the interaction between CTCF and EBV

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8/24 Lab Meeting-ingrid

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(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；經更改IP流程，可以有效率以KR(660) from ICON將KR抓下(ERKV_Dox48h)，但是之後應用於ERKV_shLuc_Dox48h、ERKV_shOGTA1_Dox48h及ERKV_shMGEA5B2_Dox48h，卻效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。目前持續改進IP流程中。Note:如果是要看KR蛋白質，建議Lysis buffer要加phosphotase inhibitor以避免KR的碎裂。 (2) 關於進行shRNA的Q-PCR，已完成實驗數據。但是分析時，應注意星號的標誌，正確為*p

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8/17 Lab meeting-蔡小丸

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1. 在HEK293細胞中共同表達KR, S634A/S636A, Luc及不同量的Pin1, 結果發現大量的Pin1會造成KR, S634A/S636A, Luc蛋白量的降低, 由於Luc已知不會與Pin1交互作用, 因此大量Pin1可能部份造成細胞general的影響了。 2. IP結果初步看到, KR及S634A/S636A會被sumo-1所修飾, Luc則沒有, S634A/S636A被sumo-1修飾的能力較差, 但仍需進一步實驗確認sumo-1修飾KR及S634A/S636A所扮演的角色。

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8/10 Lab meeting

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1. The trial of new medium KGM-2 ── comparing with medium DKSFM/EpiLife for culturing NP460hTert: (1) Cells culturing in KGM-2 showed more like triangle shape rather than elongated morphology as seeding in DKSFM/EpiLife. (2) Cells culturing in KGM-2 had slower proliferation rate (Doubling time:55.4hrs) than culturing in DKSFM/EpiLife medium (Doubling time:36hrs). 2.Different [Ca2+] treatments for

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08/10 Lab Meeting- 小夏

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1. 在TW01TetER及TW05TetER上Serum starvation的條件: 6-well種50000-100000 incubate 48h，serum free組與complete medium組相比，serum free組細胞數少，細胞長得細細長長，在細胞數與細胞型態上有差異性。 補充：根據之前flow data (call cycle analysis) 看48小時的實驗，細胞6-well種100000不至於過滿，200000細胞會過滿。所以我偏愛100000 incubate 48h的condition。接著模仿MB教授的實驗方法看看serum (glucose順道一起看)對Rta-induced cellular senescence.的重要性。(Ref） 2. Establishment of TW05-EREV： 結果： (1) PEG濃縮病毒可以提高virus infection的效率（5%至20%, combine TGFbeta可達到30%），而TGFbeta則效果不彰。 (2) 細胞先放大至6-cm dish，再種1000顆細胞至10 cm dish進行G418 selection的過程中細胞便死光。 討論： 從12-well放大不要一下就放到6-cm dish中，建議先至6-well較適當。而G418 selection的步驟應該要在細胞放大時就做，防止沒有病毒的細胞勢力擴大。 若現在手邊的細胞已經沒有綠光的存在了，便重新開始以濃縮病毒的方式感染細胞。

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