1. 計數TW05TetLuc/ER dox treat 1, 2, 3, 5, 6, 8天的細胞數。2. 以467確認Rta expression pattern 在TW01TetER及TW05TetER不同。 Rta expression level by WB: #19 ≧#16＞TW05TetER。 將再確認p21, c-Myc, p53……的表現。3. 準備HEK293, DOK, HSC3, SCC15, OECM1的genomic DNA來確認DDR1的mutation位點。4.準備HEK293, DOK, HSC3, SCC15, OECM1的cDNA來確認DDR1的isoform。
2012/2/1 Lab Meeting- 小夏 Read More »
進度報告 1. 為避免viral genome的干擾, 將系統換回TW01TetLuc及TW01TetER_16. 比較Dox處理6, 24, 48小時, CTCF binding在H19 ICR及c-Myc P2 promoter位置的量. Q-PCR結果顯示在兩個細胞中24小時CTCF結合在H19 ICR量比6小時多,並且在48小時下降; 在P2 promoter的位置, Luc細胞在三個時間點的結合量相近, ER細胞在24小時結合量上升, 48小時下降. 但, 兩組CTCF結合位置在Luc組細胞都比ER組來得多 –>加做Ctrl-6hr觀察Luc/ER兩組細胞的background差異 2. 整理過去paper報導CTCF在EBV/KSHV genome上的binding sites(CBS) –> EBV genome上約有20個位點, KSHV約有10個位點, 兩者的胃點有些有相似 –> 先focus在LCR, K-RTA/BZLF1 promoter, 及OriLyt等位置, 準備設計primers
01/11 Lab Meeting-小嬿 Read More »
製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體 (全部已clone成功)(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop(4) pGEXHis_BALF3(2)(3)(4)除pGEXHis_ER_L550stop尚未表現，其餘在BL21表達蛋白質皆不明顯增多，且皆比預測值大約6-8kDa。目前採取的策略如下(1) 使用未開封的LB/BHI或跟其他實驗室要一點LB來做control(2) 表現蛋白質時，Amp濃度提高至200ug/ml，IPTG濃度降至0.1或0.5mM，加IPTG前應養約3-5小時直到OD600=0.6，同時使用DH5α作表現。(3) 做BL21及DH5α的competent cell林同學的論文中提及她用的ER1-320中(Dr. Miller提供，疑是B95-8 strain)很多Arg皆已被突變掉，包括Arg83、86、88、89及90，在我們MABA strain，這些位置皆是Arg。另外根據PWW的紀錄，二者的核酸序列有10個不同處，但只有2個amino acid不同。
1/5 Lab Meeting-ingrid Read More »
日前投稿至Frontiers in Virology的manuscript的初次結果為minor revised報告三個reviewers的建議, 重點摘要如下:1. 針對NLS提問, 希望我們討論為何與過去發現不同 (no.1 reviewer)2. 希望能加做分析KSHV viral particle的產生情形 (n0.1-3 reviewers)3. 希望我們討論CDK9磷酸化KR的其他可能位點, 還有是否有其他CDKs結合 (n0.1-3)4. 覺得luciferase assay差異不明顯 (n0.1, 2)5. 關於KR吸引CDK9後影響Poll2下游的轉錄機制的可能假說, 覺得證據非常不足 (no.2)6. 提到KR會被IgG所直接binding (no.2)7. 要我們再詳加解釋S634A/S636A與KR 10kDa的差距是否來自於磷酸化改變 (no.2)
2011121 Lab meeting-蔡小丸 Read More »
1. 計數TW05TetER dox treat 1, 2, 3, 4天的細胞數(mix well, to count 3 times)及WST-1 activity沒有差異。建議一樣的條件只做LD與ED組別計數3天後的細胞數及測量WST-1 activity。2. TW05TetER “escapee” 的實驗，設計失敗。3. Flag抗體建議以Cell Signalling抗體來降低背景值，Rta的訊號(或雜band)用467抗體來證實。4.在TW05TetER，dox移除後，ER會隨著時間degrate，其程度與Luc相同，24小時已degrate超過一半; 若dox一直存在下，在96小時前ER的表現也都還會在。至於ER隨著時間增加而增加減少或者是持平，將會繼續釐清，將ER的Kinetics確定清楚。5. TW05EREV的9株clones以Q-PCR來看viral partical的產生，#1, #4. #7有少量particle，#2, 3, 5, 6, 8, 9則沒有偵測到particle的產生。以WB來看#1, #4. #7 lytic protein的表現Zta: 7>1>4, gp350/220: 1, 7 >4; 隨著dox的induction, #1, #4, #7 的cellular protein p63皆下降，p53皆上升。
12/7 Lab Meeting- 小夏 Read More »
進度報告: 1. 確定ChIP的前置步驟條件:Cell: 4 x 10^7 cells/ml lysis bufferSonication: 45″ ON, 45″ OFF for 10-12 cycles (depend on cell type)2. 在TW01-EREV_2716細胞中, 觀察到CTCF在Dox處理24小時後結合在cellular promoters上的量比6hrs與未處理Dox的細胞來得多. 顯示 Rta的出現可能讓CTCF對這些promoter的affinity更好. 但是在EREV8細胞中, 同樣的時間點沒辦法看到類似的情況. –> 補齊其他cellular promoter的PCR detection.–> 目前推測TW01EREV-2716走lytic cycle的速度比EREV8來得快, 可能24hr還看不到CTCF在EREV8細胞的變化. 試試在EREV8細胞中觀察48小時的CTCF ChIP.
11/23 Lab Meeting-小嬿 Read More »
1. 在ERKV細胞中，將shLUC、shOGT及shMGEA5 lentivirus分別送入，再經由Dox treatment使KSHV進入lytic reactivation，收集medium並用Q-PCR測量產生的KSHV copy number，結果依序為shLUC＜shOGT＜shMGEA5。 2. 製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體(1) pGExHis_KR_Q658stop and pGExHis_cZ :KRQ658表現蛋白量很少，以至於無法正確判斷是哪一條band，故重新表現蛋白質並以His Ab確認，同時確認質體是否錯誤(原template: GEx-2T-GST_KRQ658)；Zta蛋白質表現量極佳，已送出代製抗體。PS理論上，Zta為270aa約為30kDa，但在SDS-PAGE gel上的band為38kDa，多出8kDa?(2) pGExHis_ER_Q320stop and pGExHis_ER_L550stop(3) pGExHis_KR_E600stop and pGExHis_BALF3
11/09 Lab Meeting-ingrid Read More »
1. 測試anti-DDR1 (Sanat Cruz, C-20) IP條件, 發現增加Ab的量, 並沒有增加IP下來DDR1的量2. 測試serum free後加入collagens對於DDR1活性的影響, 在T47D這組有看到DDR1的Tyr-phosphorylation增加, 但OEC-M1的結果不同, 推測是細胞太滿之後serum free造成的影響, 因此 必須重新試條件3. 分析silence DDR1後對於下游訊息傳導的影響, 在OEC-M1及TW2.6走向不同路徑
2011026 Lab meeting-蔡小丸 Read More »
2011/10/6–7 Rehearsal2011/10/29–30 Scientific Review/Site Visit2012/2/17–18 PI Retreat Review Member:鄭院士、龔院士、楊院士、劉院士、閻校長、洪院士、院長、王副院長 PI 23 RA/postdoc 20 Director Chang JYDrug discoverypast 3-yr publicationHuR bind to HIF1a mRNA stablization (inhibited by MPT0B098)MPT0B098 decreased cytoplams translocation of HuRMPT0B292 HDAC6 inhibitorHDAC6 acetylates a-tubulinCa2+ influx STIMI Ac actinWhat is the effect of actin acetylation upon STIM1 activation?nticancer efficacy of PLGA-30MGMT modulates therapeutic efficacy
2011-2012 Rehearsal, Site Visit, and Retreat Read More »
1. TW05TetER的doubling time為22.5hr，與TW05TetLuc差不多，繼續持續觀察。將計數long-time treatment的細胞數(mix well, to count 3 times)及WST-1 activity。2. 設計TW05TetER做 “escape” 的實驗。3. The expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cellsa. 在12-96hrs之間看不出kinetics，首先將找出Flag抗體的最佳條件，將Flag-ER壓出。b. Dox induce 24hr之後wash off之後看12hr至72hr protein的degradation，結果Rta確實隨著時間degradate，但預設應該沒有變化的Luc72hr 卻也detect不到任何訊號，猜測也許是沒有加到dox(?)，將另一批sample lysis來確認這件事情。4. Establishment of TW05EREV目前有9株clones，1號細胞株先以Dox或TS induce 48hr以IFA看viral protein的分布比例; 及Q-PCR來偵測viral partical。IFA結果 Flag-Rta每一顆細胞都有，Q-PCR結果viral partical 偵測不到。未來screen clones看induction time 為72hr之後，先以Q-PCR來看viral partical是否有出來為主。
10/12 Lab Meeting- 小夏 Read More »