December 2013

https://www.addgene.org/CRISPR/ Addgene最近在賣的一系列有趣的plasmid(addgene的另外意思就是 不貴) 目的是辨識特定DNA序列，去切斷、造成Nick、抑制基因表現或是促進基因表現。 最早能辨識DNA序列的 是Zinc finger，後來出現TALEN，這兩個都是protein為主的數位編碼。 後來又有人發現CRISPR/Cas系統 CRISPR/Cas9本來是用在抵禦外來DNA，辨識序列、切斷。 整個原理 簡單的說 Cas9會利用guide RNA (特定序列+一個二級結構的RNA)去辨識DNA序列 再將雙股DNA切斷 (去防禦外來DNA入侵) 一開始被利用其實是拿來做transgene ES，增加DNA recombination 的效率。 這幾年陸續有人將enzyme activty移除，甚至做成fusion protein， 接上抑制性domain HP1/KABP)或是活化domain (VP64)，去專一性的抑制或表現特定基因。 跟Zinc finger跟TALEN比起來，其辨識主要是gRNA 序列而不是protein的排列順序(編碼) 所以可以利用合成oligo-nucletides insert 到gRNA expression plasmid去達成鑑別力， 整個彈性、速度跟CP值，完全大勝前兩項。 CRISPR抑制 (CRISPRi)也可以媲美RNAi，甚至更好。 我看其中一篇reference，他們做CRISPRi後去做Sequence，發現專一性極高，也無off-target effect。(paper data都是最漂亮的! 哈) 然後合成DNA primer的價錢，也遠比RNA 便宜很多，所以CP值跟彈性都更高。 activation部分，也可以去操作特定基因﹐的表現。可以用來證明某些未知的transcript 是來自於同一個還是獨立的。 其實在Zinc finger/TALEN的部分，也是有人將epigentic enzyme，DNMT, PRC Complex or Tet去做fusion，去達成特地區域的epigentic change。 CRISPR應該也可以做到。