2011

0615 Lab meeting-蔡小丸

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1. 再次整理Pin1對於K-RTA的影響, 結果顯示Pin1會結合至K-RTA 並且影響K-RTA之穩定性, 而Pin1結合至K-RTA是經由其WW domain, 且isomerase activity也貢獻於pin1與K-RTA之交互作用2. 此外, S634A/S636A被anti-MPM2結合的能力較差, 表示S634/S636可能是Pin1所結合的位點3. Pin1對於K-RTA活性的影響 則尚未釐清4. 完成oral cancer tissue array (OR2081)的DDR1染色

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TW01TetER相關

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(AC503, Ingrid, 2010-05-18) 6-well plate format (200K/well = 100K/ml)(1) No Dox control of both cells grew similarly before Day4, doubling time約為24h(2) #7 continued to grow between Day 4 and Day 7(3) #19 stopped to increase after Day 4 (猜測是第三天換 medium時同時移掉 死細胞)(4) YLC 將Day 8細胞拿來做SA-b-Gal staining,是positive, 但比例不詳 (AC 263 小夏) 6-well plate format (200K/well = 100K/ml)

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考慮用Bioruptor sonicate你的protein extract

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上週末Bioruptor業務幫我們把儀器fix好的同時，也提及許多Lab在置備protein extract的同時，現在都會加一步sonication的步驟。 set at “Low”, 5 cycles. 據說這樣才可以充分地把胞膜上面的蛋白質都萃取出來。有做膜蛋白的人要注意一下! 非膜蛋白的人也可以試試看多加這一步驟，protein是不是萃取得更完全。

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06/01 Lab Meeting-小嬿

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1. 設計12個target gene的CTCF binding site primers. 初步用ERKV及Raji的genomic DNA測試primer, 九組較佳, 三組較弱, 一組沒有p出來. –>後面這四組primer會再做進一步確認condition2. 利用IP觀察CTCF是否跟Rta有interaction. IP CTCF後有抓到Rta, 但其抓到的量與Dox induction與否沒有關係(偽Rta?). (使用ICON的blocking reagent後, IgG的band有比較乾淨.)3. 利用Thermo的fraction kit區分TW01TetER-19細胞的cytosol及nuclear protein. PARP1及CTCF乾淨地位於核內; Rta, p53, H3在cytosol有殘留; GAPDH及a-tubulin主要在質; 怪的是PCNA大部分在細胞質. –>1. 這篇paper指出位於質內的PCNA具有anti-apoptosis的效用(in neutrophil), 或許這是TW01細胞可以serum starvation還如此快樂的原因之一. (而一點點的PCNA在核內就夠DNA replication 用?或大部分細胞在G1 phase, PCNA不用進核工作)–>2. 試試沛文的fractionation方法–>3. 試試IP Flag, 看CTCF是否會被抓下來

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5/25 Lab Meeting-ingrid

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(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6×10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，發現shOGT-A1及shMGEA5-B2皆比shLuc引起更多的lytic reactivation。且送入shOGT的細胞樣本中，除了OGT蛋白質減少，MGEA5蛋白質也減少，送入shMGEA5的細胞樣本中，除了MGEA5蛋白質減少，OGT蛋白質也減少。重複之前收集的2次實驗樣本，也得到一樣的結果。進行Q-PCR檢查送入shOGT的細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，避免shRNA有認錯目標的效用。且用IP將KR抓下，用WB來確認O-GlcNAc變化程度。 (2) 將TW05TetER的＃7+9+10+12 (Flag Positive ratio=87~-96％) pool成一個clone。(3) 重新建立TW01TetLuc及TW05TetLuc，目前正在用Zeocin篩選clones。(4) TW05TetER/gZ有28clones進行WB篩選，Rta alone、gZ alone和Rta+gZ皆有篩出，接下來進行IFA確認。

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05/18 Lab meeting-蔡小丸

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1. 利用黃老師家學姊提供之unknown cancer tissue sample進行DDR1之IHC練習2. 試著釐清Pin1對於K-RTA蛋白質穩定性的角色及對於K-RTA transactivation ability的影響~~但結論仍在一片渾沌中~~3. DNCDK9對於K-RTA transactivation ability有抑制的效果 但仍不能排除 DNCDK9是全面性抑制了transcription

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