PiggyBac and Tien Xu
Here. 另外可考慮他向Roger Tsien要了許多fluorescent protein!
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2009
DLR 更新 (from 9/30/08 Lab Meeting 心得彙整)
小嬿的私房菜:1)ER對CMV-RL有50%抑制、對SV40-RL有66%抑制、對TK-RL有5倍活化能力,因此推薦EF1-RL為internal ctrl。2)gZ對SV40-RL有2倍活化、對TK-RL有4~5倍活化能力。3)KR對SV40-RL有80%抑制、對EF1-RL有異常高倍活化能力,因此推薦TK-RL或-hRL為internal ctrl。————————————–09/30/2008 Lab Meeting心得彙整Dual Luciferase assay: 所以,測試結果簡述如下.(1) Internal control: pFA-GAL4系列因KRTA/TA在40ng/well/24-well plate含有約1K~2K的內生性renilla luciferase活性,而vector control pFc-dbd當初卻沒有clone進去這段活性,所以最後選擇以值最高的pEF1-RL為internal control(約一萬)來蓋過KRTA/TA的basal level.(2)pLenti-Flag系列因pEF1-RL在不同activator:reporter比例被活化的程度不一, 所以選擇以variaion較少的pTK-RL或pTK-hRL為internal control.(3)以後操作DLR的SOP:第一步,找出哪個internal control不會被你的activator影響,這個數值代表的是你的每個well間transfection,passive lysis,到DLR assay這些步驟的一致性.當這個值高高低低(加減10%以上)的時候代表若非技術還待磨鍊,就是其它東西會影響這個internal control的表現量或活性,而這時候去思考firefly/renilla是…愚蠢的.第二步,activator/repressor對responsive elements常有bi-phasic mode,就是量在一個區域內是線性上升,可是在另一個高一點的區域內又會成線性壓抑(好像小富翁與大富翁對照快樂係數的比例,個人覺的一億台幣是那個分界點…ㄟ怎麼會談到這個?)所以像這次Maruko和YCK做的不同比例測試的前置實驗是需要的.Maruko:全長KR之DLR以TK-RL或TK-hRL作為internal control均可(ps.SV40-RL會被KR抑制80%活性,而EF1-RL似乎被瘋狂活化);IP進行中;latency disruption籌劃中.小嬿:(1)之前結果顯示EBV Z對SV40 promoter會有二倍活化,對TK-RL(or)TK-hRL有4~5倍活化.(2)以SV40-RL為internal control下,證實gZ,cZ可活化BHLF1-Luc,tZ is non-functional.(3)以electroporation方法證實gZ,cZ可活化p3HR1中EAD,但是endogenous Z好像沒出來(a梗?). (4)293Tet_gZ(3 clones), 293Tet_cZ(2 clones), and 293Tet_tZ持續放大篩選中.(5)下星期被吩咐要報RNA pol II pausing的paper所以(實驗進度就免了).建議實驗:(1)EBV Rta與Zta的transient-transfection實驗,仿小丸子和YCK上週做的2:1, 1:1, 1:5, 1:11條件,看看EBV Rta與Zta對其direct-binding promoter之behaviour是否相似?(2)P3HR1那一組blots,雖亂,考慮檢查endogenous Rta是否有被叫出?(用NTU ascites那一管)Ingrid:Protein purification進行中;DLR western blot analysis 進行中;pFA-GAL4活性測試條件決定,其中366AA絲毫不差地repeat了PWW結果,366EE亦上升,暗示OGlcNAc修飾會壓低TA活性.另外,全長,各clone表現量與latency
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實驗室工作分配 (定稿)
小丸子:OrionL、PCR儀器前公用區域、細胞間、咨詢。Ingrid:管帳、庫存採買、CO2/LqN2、化安、團購、同事間感情維繫。小蓮:生安、lightbox前公用區域、協助管帳及庫存採買。小嬿:藥品間、protein bench、new idea引進、發問。以上分配是可以喬的,若覺得太多或沒有分配到你的天生強項,請務必留言告知。買東西方面還是跟往常一樣,多問、多想。購買時的登錄、貨到達時的簽收、datasheet歸檔等好習慣,大家要繼續保持。 各區域負責人有任何”規矩”希望大家遵守的,請隨時提出來,謝謝。
公共區域請力求整齊清潔
知道大家都很忙,但是可不可以每天回家前再擠個五分鐘出來,把公共區域你的東西清理一下?一走入我們家一眼望去,水槽旁邊總是滿滿的、有塑膠袋、沾著乾掉牛奶的剪刀、鑷子、碎紙屑、算都算不清的大小量筒、鐵架、文具—還好還沒有臭味。然後幾乎四條bench的公用區域（不清楚自己bench上哪裡屬於公用區的請舉手）也是堆得滿滿的:shaker上有blots、儀器旁邊充著和儀器沒有相關的物品、一堆堆黑漆嗎烏的片子這裡放那裡擺, TC room、電話前的桌面就更慘了﹍ 總之呢,自己的書桌、自己的bench你要怎麼處置都可以,但是屬於公用書桌（就是放了電腦/印表機的那一半）、公用bench、公用區域要盡你所能保持整潔,讓他人在使用時是處於最佳狀態(有沒有想過別人沒有辦法像你這麼容易就找到這本資料,會是多麼沮喪?所以用畢記得放回原處,謝謝)。這其實也是一種修行,所得福德很大喔! 小結:依據senescence理論, hyperplasia是老化現象,東西變多使得有你東西的地方變多變大應該不是好現象,但願大家常保年輕慢慢老化…
Ubiquitination/Ubiquitylation
中文翻為泛素化,是一種後轉譯修飾作用。最近讀了一些文獻,發現它除了和Ub-proteasome有關以外,monoubiquitination和好幾個DNA binding protein的活性也具關聯,簡述如下:(1)UbH2B參與在RNA Pol II的elongation、H3的methylation (這裡有review)。(2)UbPCNA在修補損害過程中扮演重要角色(nas上放了一篇Cell Cycle paper在講這個)。(3)UbFANCD2-也是與DNA repair有關(paper)。(4)Ub-GAL4 (paper)。
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KSHV 2009
KSHV2009 can be found here. 剛剛開會時也提到今年本所有3~4位RA名額,每人補助5萬元。會於5月份時邀請報名者給個英文簡報,再從中挑出3~4人。博士後的話只要提出abstract即可入選,也是每人5萬元補助。另外還有一項宣布就是每年七月份的Research Day希望非PI人員踊躍報名參加優秀論文比賽(RA, Post-doc, student均可)。獎金?好像有提到,我去查查看、再po上來!
請大家幫忙
為了4/10~11的review大會中本實驗室之成果簡報,能否請各提供一張以helvetica標示的power-point slide至nas上, respectively regarding:小蓮:ERKV and E-RTA day 1,2,3,4 (both cell number count and wst-1)小丸子: flow-cytometry analysis of latency disruption in 293(Tet)/rKSHV by K-RTA WT and phosphorylation mutants.小嬿:EREV8 day 1,2,3,4,6,8 (cell number and wst-1)ingrid則請提供上上次lab meeting的power-point即可。謝謝大家!